Cyanotoxine

Cyanotoxine

Les cyanotoxines sont des métabolites synthétisés par les cyanobactéries. Elles peuvent être regroupées en fonction de leur structure chimique en trois classes, soit les peptides cycliques, les alcaloïdes et les lipopolysaccharides. Il est aussi possible de les différencier selon leurs mécanismes de toxicité. On y retrouve les hépatotoxines, les neurotoxines et les dermatotoxines[1].

Sommaire

Peptides cycliques et Hépatotoxines

Alcaloïdes et Neurotoxines

Dermatotoxines et Lipopolysaccharides (LPS)

Les dermatotoxines se retrouvent exclusivement en milieu marin salé[3],[4], alors que les LPS sont des composantes de la paroi cellulaire de toutes les cyanobactéries.

Toxicologie

Plusieurs voies dexposition sont possibles pour entrer en contact avec les cyanotoxines. Principalement, on retrouve lingestion deau contaminée et le contact primaire avec cette même eau. On suspecte que linhalation possible des toxines sous formes daérosols et la consommation dorganisme, qui aurait bio-accumulé une toxine, sont des sources dexposition plausibles[5].

Une panoplie détude toxicologique ont été effectuées pour déterminer les effets aigus, chroniques, cancérogènes et tératogènes des différentes cyanotoxines sur plusieurs organismes (majoritairement les souris) et selon plusieurs routes dexposition[1],[3],[5].

Le tableau suivant présente des valeurs de DL50 chez la souris, obtenues par injection intra-péritonéale[6].

Valeurs de toxicité aiguë de cyanotoxines
Cyanotoxine DL50 (ug/kg)
Microcystine-LR 50
Microcystine-LA 50
Microcystine-YR 70
Microcystine-RR 600
(D-Asp3) microcystine-LR 50 à 300
(D-Asp3) microcystine-RR 250
(Dha7) microcystine-LR 250
(6Z-Adda) microcystine-LR > 1200
Nodularine 50
Cylindrospermopsine (pure) 2000
Anatoxine-a et homoanatoxine-a 200 à 250
anatoxine-a(S) 20
Saxitoxine 10

À titre de comparaison, la toxicité aigüe par gavage chez la souris est située entre et 5 et 10 mg/kg de masse corporel pour la microcystine-LR, les nodularines, les cylindrospermopsines et pour lanatoxine-a. La saxitoxine (STX) présente des valeurs typiquement plus basses, soit près de 260 ug/kg chez la souris[3].

Le tableau suivant présente des valeurs de toxicité subchronique chez la souris la DSENO est la dose sans effet nocif observé[3].

Valeurs de toxicité aiguë de cyanotoxines
Cyanotoxine DSENO (ug/kg jour)
Microcystine-LR 40 (souris, gavage, 13 semaines)
Cylindrospermopsine 30 (souris, gavage, 11 semaines)
anatoxine-a 98 (souris, gavage, 28 jours)

Les tests de toxicité pour une même cyanotoxine sont difficiles à mettre en perspective car ils ne sont pas tous effectués dans les mêmes conditions (méthodes de mise en contact, organismes testés, extraits purs vs extraits algales). Dans le dernier cas, il pourrait y avoir des effets de synergie et/ou dantagonisme entre lorganisme étudié et tous les métabolites dorigine algale, contrairement à la seule présence de cyanotoxines. Il faut être prudent dans linterprétation des résultats[7]..

Normes

Les normes qui découlent des études toxicologiques sont appliquées à leau potable et aux activités qui comportent un contact avec leau. Selon le cas, elles distinguent les concentrations seuil par type de cyanotoxines ou de cyanobactéries au-delà desquelles on doit prendre des précautions et/ou des actions pour remédier à la situation. Les valeurs appliquées aux cyanotoxines prennent en compte les cyanotoxines totales, cest-à-dire celles qui sont sous la forme libre (dissoutes dans leau) et celles qui sont situées à lintérieur des cellules. Elles sont exprimées en µg/L. Le tableau suivant présente les normes actuellement en vigueur et celles qui sont proposées dans divers pays[6],[8].

Concentrations maximales tolérables de différentes cyanotoxines dans leau potable
Cyanotoxine Pays/organisation Valeurs (ug/L)
Microcystines France 1,0
Microcystines Canada 1,5
Microcystines OMS 1,0
Microcystines Brésil 1,0
Microcystines Australie 1,3*
Microcystines Nouvelle-Zélande 1,0 et 0,1**
Nodularines# Nouvelle-Zélande 1,0
Anatoxine-a# Nouvelle-Zélande 3,0
Anatoxine-a(S)# Nouvelle-Zélande 1,0
Cylindrospermopsine# Australie 1,0
Cylindrospermopsine# Nouvelle-Zélande 3,0
Saxitoxines# Brésil 3,0
Saxitoxines# Australie 3,0**%
Saxitoxines# Nouvelle-Zélande 1,0

# Valeurs proposées ou recommandées

  • Valeur qui prend en compte la toxicité de lensemble des microcystines
    • Valeur qui prend en compte leffet de promotion tumorale
      • Valeur en ug STX-équivalent/L[3]

Les valeurs utilisées au niveau de la concentration maximale tolérable de cyanobactéries sont exprimées en # cellules/mL. Les normes en vigueur à propos de la concentration maximale tolérable dans leau de consommation et dans leau contaminée utilisée pour des fins récréatives, et avec laquelle il se produit des contacts primaires, sont de 2000 et 20 000 cellules/mL respectivement[9],[1]. Comme en moyenne une cellule contient 0,2 pigogramme de toxines[6], une valeur de 2 000 cellules/mL correspond à 0,4 µg/L de toxine totale et la valeur de 20 000 cellules/mL correspond à 4 µg/L de toxine totale. Ces valeurs (cellules/mL) sont des moyennes et sont valables seulement si toutes les cyanobactéries contenues dans le volume deau sont productrices de cyanotoxines.

Analyses des cyanotoxines

Les méthodes danalyses peuvent être départagées en méthodes de criblage qui sont généralement très sensibles mais peu sélectives et en méthodes de confirmation qui sont très sélectives et présentent une sensibilité appréciable[3]. Parmi les méthodes de criblage, on retrouve les bio-essais sur différents organismes, la méthode immunologique ELISA (Enzyme linked immuno sorbent assay) et différentes méthodes enzymatiques utilisant les propriétés biochimiques des cyanotoxines. Les méthodes de confirmation sont principalement des variantes de la chromatographie liquide haute performance couplée avec différentes méthodes de détection dont la plus performante est la spectrométrie de masse, qui elle-même présente une pluralité de types danalyseurs.

Préparation des échantillons

Un obstacle important aux méthodes danalyse est la préparation de léchantillon. En effet, mis à part pour les bio-essais la préparation ne requiert que la lyse des cellules de façon à extraire les toxines intracellulaire, il est souvent nécessaire de se débarrasser de plusieurs substances pouvant créer des interférences et/ou de pré-concentrer les molécules dintérêt.

Lyse et Extraction

Les cyanotoxines sont dissoutes dans la matrice liquide ou bien sont piégées à lintérieur des cellules. Il est utile, voire nécessaire, de départager les échantillons en fonction de la matrice qui contient les toxines. Par filtration et centrifugation[10], on peut séparer les fractions solides, c'est-à-dire les cellules de cyanobactéries, de la matrice aqueuse constituant la fraction liquide.

Différentes techniques de lyses de la fraction solide sont utilisées comme le gel-dégel, la lyophilisation et la sonication (aussi nommée lultrasonication)[11]. Dautres protocoles utilisent une procédure de lyse/extraction simultanée, comme par exemple lextraction dans un solvant en ébullition et lutilisation dun micro-onde, qui permet deffectuer une extraction de type Soxhlet[12]. Lutilisation dune extraction liquide pressurisée à température élevée est aussi utilisée[13].

Présentement, aucun solvant nest universel pour lextraction de lensemble des cyanotoxines, aux différentes structures moléculaires qui présentent un caractère hydrophobe ou polaire variable. De plus, le pH de la solution dextraction est un paramètre qui est pour linstant peu compris mais qui a fort probablement un impact sur la solubilité des composés vu les groupements ionisables présents dans la majorité des cas[11].

Le tableau suivant présente les solvants qui sont majoritairement utilisés pour lextraction des grandes classes de cyanotoxines. Mis-à-part pour les microcystines, les autres solvants ne sont pas validés et font objet de proposition. Les conditions dextraction des microcystines sappliquent vraisemblablement aux nodularines qui sont des analogues structuraux des microcystines[3],[1].

Solvant dextraction et grande classes de cyanotoxines
Cyanotoxine Solvant
Microcystines Eau : Méthanol*
Anatoxines Eau légèrement acidifiée ou Eau : Méthanol
Cylindrospermopsines Méthanol ou solution acide acétique 5 %
Saxitoxines Eau : Méthanol**
  •  % de méthanol varie entre 50 et 75 %
    •  % méthanol = 25 % et pH =3 (acide acétique)

Purification et pré-concentration

Un problème inhérent à lextraction, est la co-extraction dinterférant générant un échantillon qui devient rapidement complexe. De plus, les fractions liquides, généralement aqueuse, ont une concentration très faible en cyanotoxines dissoutes. Par conséquent, il faut purifier les molécules dintérêt avant de procéder à leur quantification ou bien concentrer celles-ci de façon à dépasser les limites de quantification de lappareil danalyse[1].

Ces deux objectifs peuvent être atteints par le biais de lextraction sur phase solide qui est la méthode la plus utilisée. Dans cette technique, on fait passer la solution au travers dune cartouche rempli de particules et on élue avec un solvant adéquat nos analytes dintérêts qui ont été adsorbés sur la phase solide. La phase solide la plus courante est une phase greffée C18 qui permet de retenir efficacement les microcystines et les nodularines. Cependant, cette phase solide est peu sélective pour les autres cyanotoxines qui sont plus polaires. Récemment, une étude a démontrée les capacités de rétention des cartouches qui utilisent du charbon noir sous forme de graphite. Cette phase solide agit principalement comme une phase greffé C18, mais lorsquutilisée sous certaines conditions elle peut agir comme échangeur dions cationiques[14].

Une autre méthode chromatographique de purification et de pré-concentration des microcystines utilisent les principes dimmunoaffinité. À laide danticorps polyclonaux ou monoclonaux ajouté au support solide, on peut sélectivement retenir les molécules dintérêt et les éluer par la suite[15].

Méthodes de criblage

Les essais sur animaux ont longtemps été la méthode de détection de la toxicité des efflorescences. Évidemment, ces méthodes sont pauvres en sélectivité et en sensibilité. Ces tests ne sont maintenant utilisés que pour comprendre le mécanisme daction des toxines et tenter de dériver des normes au niveau des doses maximales tolérables quotidiennes[1].

Méthodes biochimiques

La détection des microcystines et des nodularines peut seffectuer à laide de leur activité biochimique qui est en lien avec leur mécanisme de toxicité. Ces molécules sont des inhibiteurs de protéines de types phosphatases (PP1 ou PP2A) qui exécutent la déphosphorylation de phosphoprotéines intracellulaires. Il sagit de mesurer lactivité dune quantité fixe de phosphatases, en fonction de différentes concentrations de microcystines/nodularines, avec une quantité fixe de substrat. Initialement, le substrat utilisé était un radio-isotope du 32P, mais des variantes utilisant un substrat détectable par spectrophotométrie ont été développées pour pallier les problèmes reliés à lutilisation de matériel radioactif[1],[14].

Un test semblable sapplique pour la détection de lanatoxine-a(S) par le biais de son activité sur lenzyme acétylcholinestérase. Ce test nest pas exclusif à cette toxine car les pesticides organophosphorés exhibent le même pouvoir dinhibition.ref>Agence française de sécurité sanitaire de lenvironnement et du travail (AFSSET), Évaluation des risques liés à la présence de cyanobactéries et de leurs toxines dans les eaux destinées à lalimentation, à la baignade leau de baignade et aux autres activités récréatives, juillet 2006.</ref>. Finalement, les saxitoxines peuvent être détectées à laide de leur activité biologique ils agissent comme agent bloqueur des canaux sodium de la membrane cellulaire. Le test seffectue par lincubation de ces neurotoxines avec des cellules cancéreuses de type neuroblastes, qui démontrent lexpression génétique de canaux à sodium, et de deux agents qui favorisent louverture et le processus de retour du sodium hors de la cellule. Ceci permet de maximiser lactivité de ces canaux et daméliorer la sensibilité du test. Après la période dincubation, on mesure le taux de survie des cellules par colorimétrie en fonction de la concentration de saxitoxines[14].

Méthodes immunologiques

Ces méthodes sont du type ELISA et elles sont basées sur le principe de reconnaissance de motifs structuraux présents sur une molécule définie, par des anticorps. La technique est de type compétition directe, il se produit une compétition pour le site actif de lanticorps entre une microcystine conjuguée à une enzyme (peroxydase ou phosphatase alcaline) et une microcystine contenu dans léchantillon à analyser. Après le temps dincubation, le substrat est ajouté et la concentration de microcystines-enzyme liées aux anticorps est évaluée par spectrophotométrie. Une coloration intense indique une faible quantité de microcystines libres dans léchantillon et linverse implique une forte concentration de microcystines[1],[14].

Méthodes de confirmation

Ces méthodes sont exclusivement des techniques chromatographiques couplées à une gamme danalyseurs tels la détection du rayonnement UV-visible, lémission de fluorescence et lenregistrement du spectre dabsorption avec des barrettes de diode (PDA), ainsi que les différents analyseurs utilisés en spectrométrie de masse (SM). Les techniques chromatographiques incluent les variantes de la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP), de la chromatographie en phase gazeuse (CG) et de lélectrophorèse capillaire (EC). Les variantes de la SM sont attribuables aux techniques dionisation des analytes et des détecteurs utilisés. Les techniques dionisation sont lélectronébulisation (ESI), le bombardement par atomes rapides (FAB) et lionisation-désorption laser assistée par matrice (MALDI), alors que le triple quadripôle (QqQ) ainsi que le temps de vol (TOF) sont utilisés comme analyseur[1].

Les méthodes de CLHP sur phase inversée utilise une phase stationnaire C18 hydrophobe qui retient en ordre décroissant les microcystines et nodularines, les anatoxines, les cylindrospermopsines et les saxitoxines. Ces dernières sont peu ou pas retenues et un agent de pairages dions est souvent ajouté pour augmenter la rétention de celles-ci[1],[16] Les saxitoxines sont mieux séparées en CLHP sur phase normale avec une phase stationnaire constituée de silice et de groupement amide libre[14].

Les méthodes de détection basée sur le rayonnement nécessitent la présence de groupements chromophores sur les molécules. Dans certains cas, il faut effectuer une dérivation pré ou post-colonne de façon à ajouter un groupement chromophore à lanalyte, cest le cas des saxitoxines qui sont détectées par fluorescence[3].

Les méthodes de SM utilisent majoritairement lESI comme méthode dionisation et la détection seffectue avec le triple quadripôle qui est une méthode de spectrométrie de masse en tandem (MS/MS). Le triple quadripôle permet différents modes dacquisition de spectres en fonction du patron de fragmentation désirés. On retrouve, le « multiple reaction monitoring » (MRM), le « precursor ion mode » et le « selected ion monitoring » (SIM). Cet ensemble de méthodes permet dobtenir la sélectivité nécessaire pour détecter les analogues structuraux des différentes classes de cyanotoxines grâce au patron de fragmentation[17],[4].

Une autre méthode danalyse utilise un produit de dégradation des microcystines et des nodularines résultant dune oxydation. Ce produit est analysé par CG/SM ou CLHP et détecté par fluorescence après avoir effectué une dérivation post-colonne. Cette méthode a été développé au fait que dans les matrices animales, les hépatotoxines sont liées de façon covalente aux phosphatases, et cest seulement celles qui sont libres qui sont détectées. Par conséquent, une procédure doxydation au permanganate de potassium et du métapériodate de sodium permet de libérer lacide carboxylique MMPB (acide 2-méthyl-3-méthoxy-4-phénylbutyrique) de lacide aminé ADDA[1],[18].

Les méthodes dEC utilisent la mobilité dune molécule chargée soumise à un champ électrique. Comme les cyanotoxines sont sous forme anioniques ou cationiques en fonction du pH de la matrice aqueuse, il est possible de les séparer par EC et de les détecter par UV-vis ou SM[19]. Une variante intéressante utilise lajout dun surfactant à la matrice aqueuse et celui-ci agit comme phase pseudo-stationnaire. La séparation est aux différences de solubilisation des molécules à lintérieur des micelles du surfactant et de la mobilité électrophorétique[20],[21].

La spectrométrie MALDI-TOF est en plein développement car elle ne nécessite pas la séparation du mélange au préalable par CLHP. De plus, cette méthode permet lutilisation dune très faible masse déchantillon, et comme le triple quadripôle, on peut effectuer un balayage des ions produits (post source decay PSD) qui permet de détecter les fragments dintérêts. Cependant, cette méthode provoque un bruit de fond important en fonction de la matrice qui est utilisée[22].

Avantages et inconvénients des méthodes

Le tableau suivant présente les limites de détection pour plusieurs méthodes analytiques[6],[3],[14].

Limite de détection des méthodes analytiques
Méthode Cyanotoxines Limite de détection
bio-essais (souris) Toutes 1200 µg
CLHP-UV Microcystines individuelles 0,02 µg/L
CLHP-PDA Microcystines individuelles 0,02 µg/L
CLHP-SM Microcystines individuelles 0,01 µg/L
CLHP-fluorescence Saxitoxines individuelles 34 µg/L
GC-SM Anatoxine-a 1 µg/L
CLHP-SM/SM Cylindrospermopsine 0,2 µg/L
CLHP- SM/SM Anatoxine-a 1 µg/L
Inhibition des phosphatases (radioisotopes) Microcystines et Nodularines totales 0,02 µg/L
Inhibition des phosphatases (colorimétrie) Microcystines et Nodularines totales 0,1 µg/L
MMPB (GC-SM) Microcystines et Nodularines totales 10 µg/g de foie de poisson
ELISA Microcystines et Nodularines totales 0,05 µg/L

Les bio-essais sur les animaux ont lavantage de détecter lensemble des cyanotoxines, mais ne démontrent que très peu de sélectivité face aux classes de cyanobactéries et encore moins pour différencier les variantes structurales à lintérieur dune même classe. De plus, la présence de résultats faux-positifs nest pas négligeable et la reproductibilité des résultats est faible[23]. Malgré cela, ces tests présentent la possibilité de détecter la totalité des cyanotoxines, incluant les cyanotoxines inconnues qui pourront par la suite être investiguées avec des méthodes de confirmation de façon à déterminer leur structure[3].

Les méthodes chromatographiques démontrent la plus grande sélectivité et la meilleure quantification des différentes variantes des cyanotoxines. La détection du rayonnement est moins performante au niveau de la quantification, vu la plus faible sensibilité et sélectivité comparativement à la SM. Il est également à la portée des procédures de SM de déterminer la structure exacte des nouvelles toxines. Le manque de standards certifiés est présentement linconvénient majeur de lensemble de ces techniques qui fait en sorte que lon ne détecte pas lensemble des cyanotoxines. De plus, les échantillons nécessitent une préparation préalable qui consomme du temps et génère un temps réponse relativement long[3].

Les méthodes immunologiques et biochimiques sont attrayantes vu la rapidité du temps réponse et la possibilité de détecter lensemble des variantes de la cyanotoxine étudiée. Cependant, ceci engendre nécessairement un manque dinformation sur les variantes structurelles et dans le cas de lELISA, il y a un risque de réactivité croisée faisant en sorte quil est difficile de relier la concentration de microcystines détectées à la toxicité réelle de léchantillon[6]. De façon générale les méthodes utilisées dépendent de lobjectif à atteindre et des coûts associés aux analyses. Ainsi, les méthodes immunologiques et biochimiques démontrent une sensibilité comparable aux méthodes de confirmation, à un moindre coût, et sont des méthodes de choix pour les analyses de routines. De plus, les qualifications du personnel technique sont moins exigeantes que dans le cas des méthodes de confirmation. Ces dernières sont principalement utilisées dans le cadre de recherche et développement[14].

Développement

Les méthodes de confirmation présentent la possibilité détablir des méthodes danalyses multi-toxines, qui après optimisation des conditions analytiques, permettent de minimiser les analyses et ainsi les établir comme méthodes de routine[24],[4],[17],[21].

Létude de phénomène comme la bioaccumulation, et son impact sur la consommation dorganismes infectés, nécessite un protocole dextraction des cyanotoxines intégrées à lintérieur de matrices complexes. Un protocole connu sous le nom de « dispersion de la matrice sur phase solide » utilise les propriétés dadsorption que possèdent des substances comme la silice, lalumine et le sable. Ainsi, la matrice est mélangée avec ladsorbant dans un mortier et léchantillon résultant est déposé dans une petite colonne chromatographique et les analytes sont élués sélectivement[25],[26].

Les méthodes de préparation déchantillons sont fastidieuses et plus particulièrement lextraction sur phase solide, qui peut sétendre sur une journée. Pour optimiser le temps réponse des analytes, une modification de lappareillage chromatographique peut être accomplie de façon à effectuer la purification et la pré-concentration automatiquement. Pour ce faire, il faut relier une colonne de charge à la colonne analytique par un système de valve. Ensuite, léchantillon liquide est élué sur la colonne de charge, à laide de pompes indépendantes du système chromatographique, et les analytes y sont sélectivement adsorbés, alors que léluant et les contaminants sont rejetés au rebut. Ensuite, on effectue une permutation des valves de façon à ce que la colonne de charge soit en aval de la colonne analytique et on utilise les pompes du système chromatographique pour éluer nos analytes à lintérieur de la colonne analytique. Ceci permet de diminuer drastiquement le temps total danalyse, soit moins dune heure par échantillon. Cette procédure a été utilisée avec succès pour la quantification dagents anti-infectieux dans les eaux usées[27] et il est envisageable quelle puisse très bien fonctionner pour les cyanotoxines.

Une nouvelle méthode dionisation des analytes pourraient drastiquement diminuer le temps danalyse, soit la désorption thermique induite par diode laser couplée à lionisation chimique à pression atmosphérique.

Schéma de la LDTD

Léchantillon est dissous dans un solvant qui est par la suite déposé dans une plaque analytique à 96 puits. Le solvant est séché et léchantillon solide passe en phase vapeur sous leffet dun bombardement laser. Ensuite, les analytes gazeux neutres sont ionisés chimiquement à pression atmosphérique. Ceci produit des ions moléculaires en moins de trois secondes qui sont par la suite analysés par spectrométrie de masse, pour un temps total inférieur à dix secondes. Les avantages de cette méthode, outre le temps excessivement bas danalyse, est la possibilité de programmer des rampes délévation de température, ainsi que le temps de maintien de cette température, de façon à faire passer sélectivement les analytes en phase gazeuse. Ceci fait en sorte quil nest plus nécessaire deffectuer de séparation chromatographique avant lanalyse par spectrométrie de masse. De plus, aucune matrice et solvant ne sont utilisés, réduisant la présence de bruit de fond[28]. Cette technologie a été utilisée avec succès dans le cadre de létude de linhibition du cytochrome P450[29]. Il serait donc envisageable danalyser les cyanotoxines par cette méthode à condition que les analytes se volatilisent avant de se dégrader sous leffet de la chaleur.

Notes et références

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