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Souris knock-out
Pour les articles homonymes, voir souris (homonymie).Les souris knock-out sont des souris domestiques (Mus musculus) qui ont été génétiquement modifiées pour inactiver un ou plusieurs gènes dans les cellules souches embryonnaires dont elles sont issues. Ces cellules souches étant pluripotentes, elles sont donc toutes identiques. Il faut distinguer le knock-out d'une simple recherche de mutants. Le knock-out est une mutagenèse ciblée dans la mesure où elle n'altère que la séquence du gène étudié.
Sommaire
Intérêt de cette procédure
Il est particulièrement intéressant, pour les biologistes étudiant le rôle d'un gène particulier, de « supprimer » celui-ci afin d'observer les conséquences physiologiques et cytologiques d'une telle suppression. Le but de la procédure de knock-out est donc d'étudier les effets d'un gène sur un organisme entier par son absence ou par son absence de fonctionnement, par exemple pour l'essai de médicaments thérapeutiques.
Étapes du protocole
Le protocole visant à mettre au point une souris Knock-out suit un déroulement précis. Tout d'abord il faut disposer de la séquence du gène que l'on veut supprimer. Celle-ci permettra de construire un plasmide approprié s'insérant par recombinaison homologue et de manière spécifique dans le génome de l'organisme cible, c'est-à-dire au locus précis du gène à supprimer.
Cette procédure est donc effectuée sur une cellule-souche de l'embryon (entre les stades blastula-morula, de 8 à 64 cellules) que l'on prélève, que l'on cultive, et que l'on ré-agrège à l'embryon ensuite. L'organisme obtenu sera donc un organisme mosaïque dans le sens où toutes ses cellules n'auront pas le même génome pour le gène considéré.
La seconde étape du processus consiste à réaliser un croisement entre ces individus appelés G0 et un individu de phénotype « sauvage ». Les individus G1 issus de ce croisement n'hériteront du gène inactivé que dans le cas où la (ou les) cellule souche modifiée touchait la lignée germinale des G0. Dans ce cas assez rare, 50 % des individus G1 seront hétérozygotes (KO/Sauvage) pour le gène considéré. Afin d'obtenir des homozygotes KO/KO (but de l'expérience), il faut croiser entre eux ces individus G1 entre eux, et l'on observera alors 25 % d'individus G2 homozygotes KO/KO. Par comparaison avec un groupe témoin, on peut alors procéder à l'étude fonctionnelle de ces souris KO, qui ont deux copies inactives (en réalité doublement délétées) pour le gène d'intérêt.
Enfin, ce protocole nécessite de pouvoir cribler les cellules possédant un exemplaire KO du gène. Le plus souvent, on incorpore au plasmide, entre les deux séquences homologues du gène cible, un gène étranger de résistance à un agent délétère (par exemple la néomycine).
Il faut pouvoir sélectionner les individus chez qui seule la séquence homologue entre plasmide et gène cible a été insérée (double enjambement nécessaire), ce qui est rendu possible par l'incorporation dans une autre région du plasmide d'un gène étranger de sensibilité à un agent délétère (qui permettra de cribler les cellules ayant incorporé le plasmide entier, et donc de les supprimer).
Perspectives
Cette méthode nécessite plusieurs mois et coûte très chers aux laboratoires, amenant ainsi la création de laboratoires commerciaux exclusivement spécialisés pour concevoir ces animaux expérimentaux.
Précisons également que les souris ne sont pas les seuls organismes pouvant faire l'objet d'un knock-out : tout organisme, potentiellement, peut voir l'un de ses gènes inactivé par cette technique.
Articles connexes
- Souris Kaguya, première souris ayant pour parents deux femelles, sans clonage
Liens externes
- « L'invalidation d'un gène : le « Knock-Out » », sur le site de l'Université de Jussieu
- International Knockout Mouse Consortium
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