- Purification de protéines
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La purification de protéines est une série de processus destinés à isoler une ou des protéines à partir d'un mélange complexe (cellules ou autres particules ou matrices). C'est une étape importante en recherche fondamentale pour la caractérisation de la fonction, la structure et des interactions d'une protéine d'intérêt, mais aussi en recherche appliquée et industrie pour préparer des matières et réactifs. Les différentes étapes de la purification consistent en des processus successifs de simplification du mélange complexe initial, retrait des déchets cellulaires (membranes, organites), élimination du matériel génétique, élimination ou conservation de certaines protéines en fonction de leurs caractéristiques chimiques (taille, charge électrique, affinité), isolation par affinité spécifique de la protéine d'intérêt.
Sommaire
Matériel et étapes préliminaires
Le matériel de départ est généralement constitué de tissus biologiques ou de cultures cellulaires (eucaryote ou procaryote). Ce peut aussi être des particules inertes, un mélange en solution...
Une étape de lyse consiste à rompre les parois cellulaires et membranes biologiques, en recourant notamment à des actions mécaniques (écrasement, french press, sonication), des agents solubilisants (détergents) et d'autres adjuvants d'extraction (des inhibiteurs de protéases, des antibiotiques, des chélatants, … pour protéger les protéines d'intérêt).
Une étape de solubilisation consiste à rendre les protéines solubles, généralement en phase aqueuse. Ceci est typiquement réalisé par des détergents, comme le SDS, le Triton X-100ou le Nonidet, ou agents chaotropiques (Urée), ceci en général conjointement à la lyse
Des étapes de fractionnement s'ensuivent, recourant à différentes méthodes.
Fractionnement par répartition entre phases
L'échantillon est mélangé avec un solvant polaire (solution tampon aqueuse) et un autre apolaire (solvant organique, phenol, chloroforme, …) qui ne sont pas miscibles. Les protéines se répartissent entre les différentes phases liquides selon leur solubilité respectives dans chaque solvant. On récupère la phase inférieure et/ou supérieure après décantation.
Fractionnement par précipitation différentielle
Une ou des protéines (d'intérêt, ou au contraire indésirable) sont précipitées en présence de conditions particulières. Ainsi les euglobulines (protéines solubles spéhariques) précipitent en solution aqueuse en présence des sels à partir d'une certaine concentration. Par exemple , les immunoglobulines IgG précipitent en présence de 30-60 % de sulfate d'ammonium. Outres la nature et concentration des sels, la température et le pH entrent en jeu.
Purification par déplétion
Il s'agit d'éliminer des composés indésirables, par précipitation, par adsorption, par affinité, …
Purification par interactions ioniques (chromatographie échangeuse d'ions)
Les protéines interfèrent avec un support (résine de silice ou autre, fonctionnalisé par des groupements ioniques positifs ou négatifs). Selon leur charge ionique (conditionné par le point isoélectrique (pI) et le pH du tampon), les protéines seront non fixées, retenues faiblement ou fortement, et donc séparées. Pour des purifications fines, ceci est réalisé dans des colonnes avec un débit de tampon qui peut varier, séparant ainsi les protéines selon un profil caractéristique. On collecte au cours du temps des fractions.
Purification par affinité (chromatographie d'affinité)
Le principe consiste à fixer de manière covalente un ligand (sucres, nucléotides, peptides, …) sur un support solide. Lorsque l'on met un mélange de macromolécules en présence de ce support fonctionnalisé, les macromolécules reconnaissant le ligand se fixent alors sélectivement à sa surface, ce qui permet de les séparer des autres après lavage par élution avec un tampon adéquat. On utilise notamment des anticorps comme ligand spécifiques d'antigène que l'on veut purifier. Dans ce dernier cas, on parle d'immuno-affinité.
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