Microscope électronique

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Microscope électronique construit par Ernst Ruska en 1933.

Un microscope électronique est un type de microscope qui utilise un faisceau de particules d'électrons pour illuminer un échantillon et en créer une image très agrandie. Les microscopes électroniques ont un plus grand pouvoir de résolution que les microscopes optiques qui utilisent des rayonnements électromagnétiques et peuvent obtenir des grossissements beaucoup plus élevés allant jusqu'à 2 millions de fois, alors que les meilleurs microscopes optiques sont limitées à grossissement de 2000 fois. Les deux types de microscopes électroniques et optique ont une résolution limite, imposée par la longueur d'onde du rayonnement qu'ils utilisent. La résolution et le grossissement plus grands du microscope électronique sont dus au fait que la longueur d'onde d'un électron (longueur d'onde de de Broglie) est beaucoup plus petite que celle d'un photon de lumière visible.

Le microscope électronique utilise des lentilles électrostatiques et électromagnétiques pour former l'image en contrôlant le faisceau d'électrons et le faire converger sur un plan particulier par rapport à l'échantillon. Ce mode est similaire à la façon dont un microscope optique utilise des lentilles en verre pour converger la lumière sur ou au travers de l'échantillon pour former une image.

Historique

Suite aux élaborations théoriques de Louis de Broglie en 1924, on a pu prouver en 1926 que des champs magnétiques ou électrostatiques pouvaient être utilisés comme lentilles pour les faisceaux d'électrons^[1].

Le premier prototype de microscope électronique a été construit en 1931 par les ingénieurs allemands Ernst Ruska et Max Knoll^[2]. Bien que ce premier instrument n'ait été capable de grossir les objets que de quatre cent fois, il a montré les principes d'un microscope électronique. Deux ans plus tard, Ruska construisit un microscope électronique qui dépassait la résolution possible d'un microscope optique^[2].

Reinhold Rudenberg, le directeur scientifique de Siemens, a breveté le microscope électronique en 1931, stimulé par une maladie dans la famille, pour rendre visible le virus de la poliomyélite. En 1937, Siemens commença à financer Ruska et Bodo von Borries pour mettre au point un microscope électronique. Siemens a également employé le frère de Helmut Ruska pour travailler sur des applications, en particulier avec des spécimens biologiques^[3],[4].

Durant la même décennie, Manfred von Ardenne commença ses recherches sur le microscope électronique à balayage et son microscope électronique universel^[5].

Siemens produisit le premier microscope électronique en transmission commercial, en 1939, mais en pratique le premier microscope électronique avait été construit à l'Université de Toronto en 1938, par Eli Franklin Burton et les étudiants Cecil Hall, James Hillier et Albert Prebus^[6]. La réalisation d'un microscope électronique à haute résolution ne fut possible qu'après l'invention du stigmateur par Hillier, en 1946 dans les laboratoires de RCA^[1].

Bien que les microscopes électroniques modernes puissent grossir les objets jusqu'à deux millions de fois, ils sont toujours basés sur le prototype Ruska. Le microscope électronique est un élément essentiel de l'équipement de nombreux laboratoires. Les chercheurs les utilisent pour examiner les matières biologiques (tels que les micro-organismes et les cellules), une grande variété de molécules, les échantillons de biopsie médicale, les métaux et les structures cristallines et les caractéristiques des différentes surfaces. Le microscope électronique est aussi largement utilisé pour l'inspection, l'assurance qualité et une analyse de défaillance des applications dans l'industrie, y compris, notamment, de fabrication de dispositifs à semi-conducteurs.

Types de microscopes électroniques

Microscope électronique en transmission (MET)

La forme originale de microscope électronique, le microscope électronique en transmission utilise un faisceau d'électrons à haute tension pour créer une image. Les électrons sont émis par un canon à électrons, généralement munis d'un filament de tungstène comme cathode source d'électrons. Le faisceau d'électrons est accéléré par une anode en général à 100 keV (40 à 400 keV) par rapport à la cathode, concentré par des lentilles électrostatiques et électromagnétiques, et transmis sur la cible qui est en partie transparente pour les électrons et en partie les disperse. Quand il ressort de l'échantillon, le faisceau d'électrons comporte des informations sur la structure de l'échantillon qui sont amplifiées par le système de lentilles de l'objectif du microscope. La variation spatiale de cette information (l '«image») est vue par projection de l'image électronique agrandie sur un écran fluorescent recouvert d'un matériau scintillateur, tels que le sulfure de zinc ou le phosphore. L'image peut être enregistrée photographiquement par l'exposition d'un film ou une plaque photographique directement sur le faisceau d'électrons ou un plaque phosphorée à haute haute résolution peut être couplée au moyen d'un système optique ou d'une fibre optique vers le capteur d'une caméra CCD (Charge-Coupled Device). L'image détectée par le CCD peut être affichée sur un moniteur ou dirigée vers un ordinateur.

La résolution est limitée essentiellement par l'aberration sphérique, mais une nouvelle génération de correcteurs d'aberration ont été en mesure de surmonter en partie l'aberration sphérique pour augmenter la résolution. Le logiciel de correction de l'aberration sphérique pour le MET à haute résolution (HRTEM) a permis la production d'images avec une résolution suffisante pour montrer les atomes de carbone dans des diamants, séparés par seulement 0,89 ångström (89 picomètres) et les atomes de silicium à 0,78 ångström (78 picometres)^[7],[8] au grossissement de 50 millions de fois^[9]. La capacité à déterminer la position des atomes dans des matériaux a fait de la HRTEM un outil important pour la recherche et de développement dans la nanotechnologie^[10].

Microscope électronique à balayage (MEB)

Image d'une fourmi par un microscope électronique à balayage

À la différence du MET, où le faisceau d'électrons à haute tension porte l'image de l'échantillon, le faisceau d'électrons du microscope électronique à balayage MEB (ou SEM en anglais)^[11] ne peut donner à aucun moment une image complète de l'échantillon. Le SEM produit des images par sondage de l'échantillon avec un faisceau d'électrons qui, concentré, est analysé sur une zone rectangulaire de l'échantillon (raster scanning). Sur chaque point sur l'échantillon le faisceau d'électrons incident perd de l'énergie. Cette perte d'énergie est convertie en autres formes, comme la chaleur, l'émission d'électrons secondaires de basse énergie, l'émission de lumière (cathodoluminescence) ou l'émission de rayons X . L'afficheur du SEM représente l'intensité variable de l'un de ces signaux dans l'image, dans une position correspondant à la position du faisceau sur l'échantillon lorsque le signal a été généré. Dans l'image de la fourmi de droite, l'image a été construite à partir des signaux produits par un détecteur d'électrons secondaires, le mode d'imagerie conventionnelle normal de la plupart des SEM.

En règle générale, la résolution de l'image d'un SEM est d'environ un ordre de grandeur plus faible que celle d'un MET. Toutefois, parce que l'image du SEM repose sur les processus de surface plutôt que sur la transmission, il est en mesure de livrer des images d'objets de plusieurs centimètres avec une grande profondeur de champ, dépendant de la conception et du réglage de l'instrument, et il peut ainsi produire des images qui sont une bonne représentation en trois dimensions de la structure de l'échantillon.

Microscope électronique par réflexion

Dans le microscope électronique par réflexion, comme dans le microscope électronique en transmission, un faisceau d'électrons est incident sur une surface mais, au lieu d'utiliser la transmission (MET) ou des électrons secondaires (SEM), c'est le faisceau réfléchi d'électrons, dispersés par élasticité, qui est détecté. Cette technique est généralement associée à la Reflection High Energy Electron Diffraction (RHEED) et la réflexion à haute énergie du spectre de perte (RHELS). Une autre variante est Spin-Polarized Low-Energy Electron Microscopy (SPLEEM), qui est utilisé pour regarder la microstructure de domaines magnétiques^[12].

Microscope électronique à balayage en transmission

(MEBT ou STEM pour Scanning transmission electron microscopy) est un type de modèle dont le principe de fonctionnement allie certains aspects du microscope électronique à balayage et du microscope électronique en transmission. Une source d'électrons focalise un faisceau d'électrons qui traverse l'échantillon. Un système de lentilles magnétiques permet à ce faisceau de balayer la surface de l'échantillon à analyser.

Préparation des échantillons

Un insecte recouvert d'or avant d'être examiné avec un microscope électronique à balayage.

Les matériaux appelés à être regardés sous un microscope électronique peuvent nécessiter un traitement afin de produire un échantillon approprié. La technique requise varie selon le modèle et l'analyse requise :

• Fixation chimique pour les spécimens biologiques visant à stabiliser la structure macromoléculaire mobile du spécimen par réticulation chimique des protéines avec des aldéhydes tels que le formaldéhyde et le glutaraldéhyde, et les lipides avec le tétroxyde d'osmium.
• Cryofixation - gel rapide du spécimen, à la température de l'azote liquide voire de l'hélium liquide, afin que l'eau forme de la glace vitreuse (non cristalline). Cela préserve le spécimen dans un état instantané de sa solution. Tout un champ appelé cryo-microscopie électronique est dérivé de cette technique. Avec le développement de la cryo-microscopie électronique de sections vitreuses (CEMOVIS), il est maintenant possible d'observer des échantillons de pratiquement tous les spécimens biologiques dans un état proche de leur état naturel.
• Déhydration - lyophilisation, ou remplacement de l'eau par des solvants organiques comme l'éthanol ou l'acétone, suivi de la phase critique de séchage ou d'infiltration de résines d'enrobage.
• Intégration des spécimens biologiques : après la déshydratation des tissus pour l'observation dans le microscope électronique à transmission, le spécimen est intégré, c'est-à-dire sectionné. Pour ce faire, le tissu est passé au travers de «solvants de transition», tels que le propane et l'époxy puis infiltré avec une résine, telle que la résine époxy Araldite ; les tissus peuvent également être intégrés directement dans l'eau avec de la résine acrylique. Après la polymérisation (durcissement) de la résine, l'échantillon est sectionné en minces tranches et coloré ; il est alors prêt pour l'observation.
• Intégration des matériaux : après incorporation dans la résine, le spécimen est habituellement poli avec un fini de type miroir en utilisant des produits abrasifs ultra-fins. Le processus de polissage doit être effectué avec soin afin de minimiser les rayures et autres artefacts dus au polissage, qui réduisent la qualité de l'image.
• Sectionnement : on produit de fines tranches du spécimen, semi-transparentes aux électrons. Celles-ci peuvent être coupées avec un ultramicrotome au tranchant de diamant, pour produire des tranches sur 60-90 nm d'épaisseur. Des tranchants jetables en verre sont également utilisés car ils peuvent être réalisés en laboratoire et sont beaucoup moins chers.
• Métallisation : utilisation de métaux lourds comme le plomb, l'uranium ou le tungstène pour disperser les électrons d'imagerie et donc donner du contraste entre différentes structures, étant donné que de nombreux matériaux (notamment les biologiques), sont à peu près «transparents» aux électrons (objets à faible phase). En biologie, les spécimens peuvent être soit traités "en bloc" avant l'intégration, soit plus tard, après lamélisation. Généralement les fines tranches sont colorées pendant plusieurs minutes avec une solution aqueuse alcoolisée d'acétate d'uranyle, puis de citrate de plomb aqueux.
• Freeze-fracture ou gel-etch : mode de préparation particulièrement utile pour l'examen des membranes de lipides et des protéines intégrées en vue de face. Les tissus frais ou cellules en suspension sont congelés rapidement (cryofixed), puis fracturés par simple cassure ou à l'aide d'un microtome, tout en étant maintenus à la température de l'azote liquide. La surface froide fracturée (parfois «gravée» en augmentant la température à environ --100 °C pendant plusieurs minutes pour que la glace sublime) est ensuite contrastée avec des vapeurs de platine ou d'or, à un angle moyen de 45° dans un évaporateur à vide. Une deuxième couche de carbone, pulvérisé perpendiculairement au plan moyen de la surface est souvent appliquée pour améliorer la stabilité du revêtement. Le spécimen est ramené à température et pression ambiante, puis la réplique métallique extrêmement fragile est détachée de la matière biologique sous-jacente par une délicate digestion chimique par des acides, une solution d'hypochlorite ou des détergents SDS. Le reste, encore flottant, est soigneusement lavé des résidus chimiques, soigneusement accroché sur les grilles du microscope, séché puis observé dans le MET.
• Ion Beam Milling : amincissement de l'échantillon jusqu'à ce qu'il soit transparent aux électrons par bombardement d'ions (en général d'argon) de la surface.
• Conductive Coating - ultrathin : Une couche de matériau conducteur électrique est déposée, soit par évaporation sous vide de haut en bas, soit par pulvérisation sous vide sur l'échantillon. Ceci est effectué pour éviter l'accumulation de champs électriques statiques dans l'échantillon, en raison de la nécessaires irradiation d'électrons au cours de l'imagerie. Ces couches comprennent de l'or, or/palladium, du platine, du tungstène, du graphite etc.. et sont particulièrement importantes pour l'étude des spécimens en microscopie électronique à balayage. Une autre raison d'appliquer un tel revêtement, même quand il y a assez de conductivité, est d'améliorer le contraste, ce que l'on fait plus couramment lors de l'utilisation d'un FESEM (émission de champ SEM). Quand de l'osmium est utilisé, il est possible d'appliquer une couche plus mince qu'avec l'un des revêtements mentionnés précédemment^[13].

Inconvénients

L'image au microscope électronique à balayage représente une partie de la structure du filtre du krill antarctique : les soies de premier ordre portent des soies de second ordre. Ces dernières sont alignées en forme de V, en direction du gosier. La boule rose montrée coincée dans les soies du second ordre mesure un micron, il est possible que ce soit une bactérie. Pour représenter toute la surface de cette structure fascinante, il faudrait juxtaposer 7500 exemplaires cette image.

Les microscopes électroniques sont chers à construire et à entretenir, mais les coûts de fabrication et de fonctionnement des systèmes de microscope confocal dépassent maintenant ceux des microscopes électroniques de base. Ils sont dynamiques plutôt que statiques dans leur fonctionnement, nécessitant la fourniture d'une haute tension très stable, de courants à chaque bobine électromagnétique / lentille extrêmement stables, vide ou ultra-vide continuellement pompé, et un refroidissement par circulation d'eau des lentilles et des pompes. Comme ils sont très sensibles aux vibrations et aux champs magnétiques externes, les microscopes, pour permettre des résolutions supérieures, doivent être logés dans des bâtiments stables (parfois souterrains), avec des systèmes spéciaux tels que des systèmes d'annulation du champ magnétique. Certains microscopes électroniques de bureau à faible tension ont des capacités MET à très faible tension (autour de 5 kV), sans tension d'alimentation stricte, sans eau de refroidissement ni isolement de vibrations. Ils sont beaucoup moins coûteux à l'achat et bien plus facile à installer et à entretenir, mais n'ont pas la même résolution ultra-élevée (échelle atomique) que de plus grands instruments.

Les échantillons doivent généralement être examinés dans le vide, car les molécules qui composent l'air dispersent les électrons. Une exception est le microscope électronique à balayage environnemental, qui permet à des échantillons hydratés d'être observés à basse pression (jusqu'à 2.7 kPa) en milieu humide. Les microscopes électroniques à balayage sont habituellement plus efficaces pour des matériaux semi-conducteurs ou conducteurs, mais des matériaux non conducteurs peuvent être traités par des microscopes électroniques à balayage environnemental. Une technique de préparation consiste à enrober l'échantillon avec une couche de quelques nanomètres de matériau conducteur, comme l'or, à partir d'une machine à pulvérisation cathodique, mais ce processus peut de perturber les échantillons délicats.

Les spécimens petits et stables tels que les nanotubes de carbone, de diatomées frustules et petits cristaux de minéraux (les fibres d'amiante, par exemple) ne nécessitent pas de traitement spécial avant d'être examinés dans le microscope électronique. En ce qui concerne les échantillons de matériaux hydratés, presque tous les spécimens biologiques doivent être préparés de diverses façons pour les stabiliser, réduire leur épaisseur (ultrathin sections) et pour accroître leur contraste (coloration). Ces processus peuvent mener à des artefacts, mais ils peuvent généralement être identifiés en comparant les résultats obtenus à l'aide de méthodes de préparation radicalement différentes. Les scientifiques travaillant dans le domaine estiment généralement, après comparaison des résultats des différentes techniques de préparation, qu'il n'y a pas de raison qu'elles produisent toutes des artefacts similaires, et qu'il est donc raisonnable de croire que les images fournies par la microscopie électronique correspondent à la réalité des cellules vivantes. En outre, les résultats à plus haute résolution ont été directement comparés aux résultats de la cristallographie aux rayons X, en fournissant une confirmation indépendante de la validité de cette technique. Depuis les années 1980, l'analyse de spécimens cryofixés ou vitrifiés, est aussi devenue de plus en plus utilisée par les scientifiques, qui confirment la validité de cette technique^{[14],[15],[16]}.

Notes et références

• (en) Cet article est partiellement ou en totalité issu de l’article de Wikipédia en anglais intitulé « Electron microscope » (voir la liste des auteurs)

Liens externes

• (en)Science Aid: Electron Microscopy High School (GCSE, A Level) resource
• (en)Cell Centered Database - Electron microscopy data

Général

• Nanohedron.com | Nano image gallery de belles images obtenues avec des microscopes électroniques.
• electron microscopy Site Internet de l'ETH de Zurich: Très bon graphisme et des images qui illustrent différentes procédures.
• Environmental Scanning Electron Microscope (ESEM)
• X-ray element analysis in electron microscope – Portail d'information avec Microanalyse aux rayons X et EDX

Historique

• John H.L. Watson: Very early Electron Microscopy in the Department of Physics, the University of Toronto – A personal recollection
• Rubin Borasky Electron Microscopy Collection, 1930-1988 Archives Center, National Museum of American History, Smithsonian Institution.

Autres

• The Royal Microscopical Society, Electron Microscopy Section (UK)
• Albert Lleal microphotography. Scanning Electron Microphotography Coloured SEM

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