Microscopie STED

La microscopie STED (stimulated-emission-depletion ou déplétion par émission stimulée) ^[1] est une microscopie de fluorescence à balayage dont l'illumination est mise en forme pour dépasser la limite de résolution imposée par la diffraction. Cette limite est dépassée en utilisant l'émission stimulée pour éliminer la fluorescence dans les régions extérieures de la réponse impulsionnelle optique d'excitation. La largeur de la zone centrale pouvant encore émettre de la lumière est ajustée grâce à la saturation de la fluorescence.

Cette technique permet d'atteindre une résolution de 35 nm en champ lointain.

Principe : étouffer l'excitation des molécules périphériques

Le moyen sans doute le plus direct pour affiner le point focal de fluorescence est d'inhiber sélectivement la fluorescence dans ses parties extérieures. Si ceci est appliqué à un faisceau limité par la diffraction, on peut s'attendre à ce que la barrière de diffraction soit dépassée puisqu'un point focal plus petit signifie résolution spatiale augmentée. L'émission stimulée est un phénomène physique qui peut arrêter la fluorescence (émission spontanée) : c'est l'une des clés du STED. Cependant, le STED par lui même ne pourrait vraiment dépasser la limite de diffraction puisque les faisceaux avec lesquels travaille le STED sont eux-mêmes limités par la diffraction. Le point crucial pour dépasser cette limite de diffraction réside dans le lien non linéaire entre la fluorescence non-linéaire et l'excitation (saturation de l'inhibition de fluorescence).

Le dispositif expérimental repose sur deux lasers impulsionnels synchronisés. L'excitation est réalisée par une impulsion qui est réglée sur le spectre d'absorption du colorant (fluorophore). Cette impulsion est focalisée sur l'échantillon, produisant un point focal limité par la diffraction grâce aux molécules excités. Cette excitation est immédiatement suivie par une impulsion de déplétion : l'impulsion STED. L'impulsion STED est décalée fréquentiellement vers le rouge (grandes longueurs d'onde) par rapport au spectre d'émission du colorant de telle sorte que les photons obtenus, moins énergétiques, n'agissent idéalement que sur les molécules excitées pour les éteindre par émission stimulée (retour à l'état fondamental). Les molécules affectées par l'emission STED ne peuvent plus fluorescer car leur énergie a été « séquestrée » par l'impulsion STED. Il faut enfin moduler spatialement le faisceau STED. En utilisant un faisceau en anneau (doughnut), seules les molécules à la périphérie du faisceau sont éteintes. Au centre de l'anneau, où le faisceau STED s'évanouit, la fluorescence reste intacte.

Principe de la microscopie STED. À gauche : profil transverse du faisceau d'excitation. Au centre : faisceau de désexcitation. À droite : fluorescence résultante.

Références

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