ATPmétrie

L'ATPmétrie est une technique de biologie moléculaire, basée sur le principe de la bioluminescence, qui permet de mesurer la quantité d'ATP présente dans un échantillon.

Principe

Schéma général des réactions de bioluminescences

Chez la luciole, la réaction de bioluminescence a lieu grâce à une activation préalable de la luciférine par l'hydrolyse d'adénosine triphosphate (ATP). Si les concentrations en luciférine-luciférase et en oxygène sont maintenues constantes, alors l'intensité lumineuse est proportionnelle à la quantité d'ATP. En utilisant la luciférine et la luciférase de la luciole, il est donc possible, grâce à un luminomètre, d'obtenir une évaluation de la quantité d'ATP dans un échantillon. La valeur obtenue en unité relative de lumière (URL ou RLU en anglais), permettra grâce à un étalon d'estimer la quantité d'ATP.

Intérêt

L'ATP est la première source d'énergie de toute cellule vivante et l'on considère que chaque bactérie en contient environ 1 femtogramme. Il est alors possible grâce à cette méthode d'avoir une estimation instantanée de la biomasse totale contenue dans un échantillon en mesurant l'ATP intracellulaire : il faut alors filtrer l'échantillon et lyser les bactéries pour libérer leur ATP

Dans l'eau

Cette méthode ne permet pas d’identifier les bactéries, mais elle permet d’estimer le risque de développement dans l'eau d'amibes, donc de biofilms, et de bactéries pathogènes comme les Légionelles. En effet, la colonisation des surfaces (paroi des conduites d'eau, des systèmes de climatisation) par de la biomasse ou des biofilms est un facteur important du risque de développement des Légionelles et d'autres bactéries comme Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus. La surveillance de la biomasse active permet donc d’estimer le risque et de le contrôler. Les coûts de charges d’une installation et son impact sur l’environnement sont ainsi réduits par l’optimisation de l’utilisation des biocides. La rapidité de cette méthode permet un contrôle quotidien afin de réagir rapidement à toute variation de la biomasse dans une installation, contrairement aux méthodes classiques comme la culture cellulaire ou la PCR quantitative.

• Biologie des eaux : méthodes et techniques 1988-1994 Champiat. D, Larpent JP Ed : Masson

Dans le sang et les fluides biologiques

Si l'ATPmétrie est opérationnelle pour mesurer l'ATP dans l'eau, elle est actuellement testée pour une application au sang, en particulier, et à d'autres fluides comme l'urine, afin de détecter précocement les risques d'infections d'origine bactérienne. La méthode se heurte à l'heure actuelle aux nombreux inhibiteurs présents dans les liquides biologiques.

• Biochimiluminescence and biomedical applications 1994 D. Champiat & al Cell Biology and Toxicology Volume 10, Numbers 5-6,

Extension de l’ATP métrie

Il est apparu un engouement pour l'ATPmétrie, il y a une vingtaine d'année avec l'ensemble des kits de dosages intégrés proposés sur le marché. Ces kits de dosage, bien qu'apportant un certain confort (en termes de rapidité et de facilité d'utilisation) par rapport aux méthodes dites traditionnelles (5 minutes au lieu de 2880 minutes) donnent des résultats fortement erronés et de ce fait difficilement interprétable:

Témoin Interne/ Nucléotides Adényliques

Les résultats sont toujours en RLU (Relative Light Unit) et non en concentration réel d'ATP. Or, on a montré :

Ajout dosé

Selon le prélèvement, même sur un même site, les RLU pour une même quantité d'ATP peuvent varier de 1000%. On peut y remédier en grande partie par le témoin interne ou l'ajout dosé, sans que la manip soit ni plus longue et ni plus coûteuse.

Nucléotides Adényliques

La concentration en ATP dans une cellule varie en fonction de son état physiologique, alors que pour une cellule "adulte" vivante le taux des Nucléotides Adényliques (NA) est constant. D'où l'intérêt de doser les concentrations en NA (ATP+ADP+AMP) intra et extra cellulaire. (Et ceci sans allonger le temps de réponse par rapport au dosage de l'ATP seul). Ainsi, non seulement nous augmentons le seuil de détection (Dans presque tous les cas étudiés à ce jour, on a gagné un facteur de 3 logs et nous avons même atteint un facteur de 5 logs). Ceci s'explique très bien par l'état physiologique de la biomasse dominante du milieu. Déjà toute cellule vivante, à l'état de vie ralentie (spore par exemple) non pratiquement pas d'ATP mais beaucoup d'AMP. Ceci nous amène au deuxième point

Comparaison ATP métrie et méthode traditionnelle

La comparaison entre l'ATP et le dénombrement par milieu de culture est aussi une aberration. En effet, même si la corrélation est excellente en culture pure, Il ne faut pas oublier que tous les micro-organismes ne poussent pas sur les milieux de culture dit "flore totale" et que l'on fait abstraction totale des anaérobies. Alors que par le dosage des NA toutes les cellules vivantes (excepté les virus) sont mis en évidence… Il y a aussi l'aspect de distinction des NA microbien des autres cellules somatiques par exemple: Il a des méthodes qui permettent de les différencier. Mais là est un autre débat. Car dans le cadre, d'un contrôle d'hygiène par exemple, n'est-il pas plus important de savoir s'il n'y a plus de résidu de matière "bio-organique" vivante, puisque l'on peut déterminer aisément les NA extra-cellulaires (donc les cellules mortes) des NA intracellulaires (donc des cellules potentiellement revivifiables)? D'autant que sur ce principe, nous avons mis et pouvant mettre en évidence "l'efficacité" d’antiseptique, de détergent, d'antibiotique, de désinfectant, de fongicide, de phage…etc. en temps réel. En conclusion, la méthode dit "ATP-métrie" est une excellente méthode pour montrer l'efficacité d'une technique de nettoyage mais à condition de ne pas se cantonner à des RLU de je ne sais quoi. En effet par le dosage en concentration de NA, nous avons des informations en moins de 5 minutes sur les contaminations "bio-organique", et donc entre autres la présence de micro-organismes avec leur état physiologique, quel que soit leur système trophique (aérobie ou anaérobie), ce que n'autorise pas les méthodes traditionnelles (pour les anaérobies 28800 minutes contre 5 minutes).

• Biochimiluminescence : principes et applications. 1993 D. Champiat & J.P Larpent Biotechnologies Masson 1993 531 p
• Applications of biochemiluminescence to HACCP 2001 Dominique Champiat & Al Luminescence Volume 16, Issue 2, pages 193–198, March/Avril 2001

Aujourd'hui l’"ATP-métrie" et encore mieux la NA-métrie non seulement permet la détection et le dosage global de la Micro-biomasse de n'importe quels écosystèmes (Naturel ou artificielle), mais aussi la quantification spécifique de n’importe quel microorganisme en temps réel et in situ.

Brevets

• ATP-metry for detecting and counting viruses D. Champiat 2004
• ATP-metry based on intracellular Adenyl Nucleotides for detecting and counting cells, use and implementing method for determining bacteria in particular devoid of ATP. D.Champiat 2004

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