Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes
Page d'aide sur l'homonymie Pour les articles homonymes, voir Fret (homonymie).

Le transfert d'énergie entre molécules fluorescentes ou transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET, acronyme de l'anglais Förster resonance energy transfer), bien quobservé par Perrin au début du XXe siècle, est décrit pour la première fois par Förster en 1946. Les applications de cette approche à létude des interactions protéiques apparaîtront vers la fin du XXe siècle[1].

Figure 1. Conditions du FRET. A. Un FRET peut apparaître seulement si le spectre démission du donneur recouvre le spectre dexcitation de laccepteur. Ce recouvrement est défini par une intégrale de recouvrement J. B. Un FRET est observé si la distance séparant les deux fluorophores est inférieure à 1.8 x le rayon de Förster (R0 ). Ce dernier définit la distance donneuraccepteur pour laquelle lefficacité du transfert dénergie est de 50 %. C. Importance de lorientation relative des dipôles du donneur et de laccepteur pour la mise en place dun transfert dénergie.

Sommaire

Conditions du transfert dénergie

Daprès la théorie de Förster, le FRET est défini comme un transfert dénergie non radiatif (sans émission de lumière) résultant dune interaction dipôledipôle entre deux molécules (donneur et accepteur dénergie)[2]. Ce phénomène physique nécessite une compatibilité énergétique entre ces molécules. Cela signifie que le spectre démission du donneur doit recouvrir, au moins partiellement, le spectre dabsorption de laccepteur (Figure 1.A). Ce recouvrement des spectres est défini par une intégrale appelée intégrale de recouvrement J(λ:

 J = \int f_{\rm D}(\lambda) \, \epsilon_{\rm A}(\lambda) \, \lambda^4 \, d\lambda

fD est lintensité de la fluorescence émise par le donneur à une longueur donde donnée et \epsilon_{\rm A} le coefficient dextinction molaire de laccepteur. Le facteur J reflète donc la capacité dune paire de fluorophores à émettre et absorber de lénergie à la même longueur donde.

En accord avec la théorie de Förster, le FRET est un processus qui dépend de la distance séparant les deux molécules, donneur et accepteur, comme le montre la formule suivante :

E=\frac{1}{1+(R/R_0)^6}\!

R est la distance effective qui sépare les deux molécules et R0 le rayon de Förster. Ce dernier correspond à la distance donneur - accepteur pour laquelle lefficacité du transfert dénergie est de 50% (Figure 1.B). Cette distance, qui dépend de la nature des fluorophores utilisés, est généralement comprise entre 1 et 10 nm[3]. Au-delà de cette gamme, lefficacité du transfert dénergie chute très rapidement. Lexpression mathématique pour le calcul de cette distance sécrit :

 {R_0} = (10^{-3} \; \kappa^2 \, n^{-4} \, Q_D \, J)^{1/6}\times9730

J est lintégrale de recouvrement, n lindice de réfraction du milieu (n 4 est généralement compris entre 1/3 et 1/5), QD le rendement quantique du donneur en absence daccepteur et κ2 le facteur dorientation qui est fonction de lorientation relative des dipôles du donneur et de laccepteur (Figure 1.C). Même si la valeur de κ2 est théoriquement comprise entre 0 et 4, 2/3 est la valeur habituellement utilisée pour déterminer le R0. En effet, κ2 est assimilé à 2/3 lorsque le donneur et laccepteur présentent un degré de liberté suffisant pour être aléatoirement orientés dans lespace[2]. Cette condition est généralement satisfaite pour les fluorophores attachés à des biomolécules car ils peuvent avoir une certaine liberté de rotation[4].

Caractéristiques photophysiques d'un fluorophore

Une molécule capable démettre un signal de fluorescence est qualifiée de fluorophore. Différentes caractéristiques photophysiques permettent de le définir :

- les spectres dexcitation et démission. Ils représentent la signature de la structure énergétique du fluorophore. La différence de longueur donde séparant leur maximum sappelle le déplacement de Stokes.

- le coefficient dextinction molaire (ε). Il correspond à la capacité dabsorption par le fluorophore de lénergie apportée par un photon à une longueur donde donnée.

- le rendement quantique (Φ). Il caractérise la capacité du fluorophore à re-émettre sous forme de lumière, lénergie absorbée. Il est défini comme étant le rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés.

- la durée de vie de fluorescence (τ). Elle représente le temps de séjour moyen du fluorophore dans son état excité.

Voir aussi l'article sur la fluorescence.

Comment mettre en évidence le FRET ?

Le FRET mesure des intensités. Expérimentalement, ce signal peut être mesuré à laide dun fluorimètre ou en microscopie. Dans un fluorimètre, le signal de FRET mesuré provient d'une population cellulaire disposée dans des puits de taille différente selon les microplaques utilisées. En revanche, les techniques microscopiques mesurent des évènements de transfert dénergie à léchelle subcellulaire. Quel que soit le type de détection choisi, la mesure dun FRET entre deux fluorophores peut être effectuée de différentes manières.

La première consiste à quantifier les variations de lintensité de fluorescence en mesurant la diminution de la fluorescence du donneur[5], laugmentation de celle de laccepteur [6] ou en calculant un rapport que nous appellerons ratio (fluorescence démission de laccepteur/fluorescence démission du donneur)[7]. Cette analyse est réalisable aussi bien en microplaque quen microscopie. La principale difficulté danalyse de ces signaux vient du recouvrement pouvant exister entre les spectres dexcitation et démission des fluorophores utilisés. Ce manque de sélectivité spectrale est à lorigine dun important bruit de fond avec comme conséquence une réduction de la sensibilité du test. Des couples de fluorophores tels que la fluorescéine/rhodamine ou les protéines CFP (Cyan fluorescent protein) / YFP (Yellow fluorescent protein) présentent ce type de limitation[8]. Cependant, le signal sur bruit du FRET peut être amélioré en saffranchissant dune partie des signaux parasites grâce à une lecture en temps résolu. Ceci est possible en TR-FRET (Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer) grâce à lutilisation de fluorophores à durée de vie longue tels que les chélates ou cryptates de terre rare (europium, terbium). À ce jour, le TR-FRET est appliqué uniquement dans des formats microplaques.

Dautres méthodes permettent de déterminer indirectement lexistence dun FRET par photoblanchiment (pbFRET). Le photoblanchiment est une méthode qui consiste à éteindre un fluorophore par une exposition prolongée à une source lumineuse. La mise en œuvre de cette approche est préférable en microscopie confocale car il est ainsi possible dobtenir une bonne résolution spatiale pour éteindre directement les fluorophores dans leur environnement cellulaire.

Dans le cas du FRET par photo-blanchiment (pbFRET), le photoblanchiment du fluorophore donneur entraîne une diminution de son intensité de fluorescence qui est mesurée en présence ou non daccepteur. Lorsque laccepteur est en étroite proximité avec le donneur, un FRET apparaît et entre en compétition avec le processus de photoblanchiment. Cette compétition se traduit par une augmentation de la résistance du donneur au photoblanchiment dont les constantes de temps mesurées (en présence ou non daccepteur) permettent de mettre en évidence un transfert dénergie [9].

Une autre alternative au pbFRET du donneur est le pbFRET de laccepteur aussi appelé DFRAP pour donor fluorescence recovery after acceptor photobleaching. Les émissions de fluorescence du donneur et de laccepteur sont mesurées avant et après photoblanchiment de laccepteur. Laugmentation de la fluorescence du donneur après destruction de laccepteur est argument pour prouver lexistence dun FRET entre les deux molécules[10],[11]. Lexemple de la Figure 2 illustre ce principe. Dans cette expérience une protéine de fusion formée de deux protéines auto-marquantes, SNAP-tag et CLIP-tag (self-labeling protein tag), est exprimée à la surface de cellules HEK293T via un ancrage par une hélice alpha transmembranaire (Figure 2A).

Figure 2. Retour de fluorescence du donneur d'énergie par photoblanchiment de l'accepteur. A. Principe. B. Spectres d'émission et d'absorption du donneur (AlexaFluor 488) et de l'accepteur (Cyanine 5). C. Images de cellules HEK293T (membranes plasmiques) obtenues en microscopie confocale (Zeiss LSM700). Rouge: Cy5, Vert: Alexa488. D. Variation de l'intensité de fluorescence du donneur et de l'accepteur au cours du photoblanchiment.

Ces protéines de 20 kDa, toutes deux dérivées de lO6-alkylguanine-DNA alkyltransferase humaine (AGT), sont respectivement marquées de manière spécifique avec des composés de type O6-benzylguanine (BG) et O2-benzylcytosine (BC) portant un fluorophore. La protéine SNAP-tag est marquée avec un dérivé BG-AlexaFluor 488 (Alexa488) et la protéine CLIP-tag avec un dérivé BC-Cyanine 5 (Cy5) (Figure 2A). La forte proximité entre les fluorophores au sein de la protéine de fusion ainsi que le recouvrement du spectre démission du donneur (Alexa488) avec le spectre dabsorption de laccepteur (Cy5) (Figure 2B, surface hachurée) sont deux conditions favorables à létablissement dun transfert dénergie intramoléculaire (Figure 2A). Ce transfert dénergie peut être mis en évidence par laugmentation du signal de lAlexa488 (500 - 600 nm) après photoblanchiment du Cy5 (Figure 2C, 2D). Dans cette expérience laccepteur a été complètement photoblanchi cest-à-dire jusquà ce que son signal (650 - 700 nm) après photoblanchiment se trouve au niveau du signal provenant de cellules voisines non transfectées (bruit de fond). Lefficacité du transfert dénergie EA dans cette expérience de photoblanchiment de laccepteur peut être calculée à partir de la formule suivante :

EA = FDpostFDpre / FDpost = E × α × β

FDpost représente le signal du donneur après photoblanchiment de laccepteur et FDpre représente le signal du donneur avant photoblanchiment de laccepteur. α est la fraction de donneur interagissant avec laccepteur et β la fraction daccepteurs photoblanchis par rapport à la fluorescence initiale de laccepteur avant photoblanchiment (100% dans cette expérience). Comme il sagit ici dune protéine de fusion avec en tandem les deux protéines SNAP-tag et CLIP-tag portant respectivement le fluorophore donneur et accepteur (rendement de marquage de SNAP-tag et CLIP-tag = 100%), la valeur de α est égale à 1. De fait, la valeur de lefficacité du FRET mesurée est égale à lefficacité du FRET réelle. Dans cette expérience lefficacité du FRET a été calculée à partir de la moyenne des mesures réalisées sur 30 cellules différentes. La valeur obtenue pour E est de 39 ± 6 % (± standard déviation). En ignorant les possibles changements dorientation relatifs des moments dipolaires de lémission du donneur et de labsorption de laccepteur on peut déterminer la distance apparente entre les deux fluorophores, d = 60 Å (ångström).

Plus généralement le DFRAP utilise la paire de protéines fluorescentes CFP/YFP. Cependant des travaux publiés en 2005 ont permis de mettre en évidence que le photoblanchiment de la YFP s'accompagne de l'apparition d'un signal de fluorescence dans le canal de la CFP et cela en absence de CFP[12]. Ces travaux montrent aussi que la Citrine et la Venus peuvent, après photoblanchiment, générer des espèces présentant une émission similaire à celle de la CFP. Le mécanisme de conversion de la eYFP, Citrine et Venus en CFP-like n'est à ce jour pas connu.

Lutilisation de la durée de vie de fluorescence du donneur est aussi une approche adaptée à la mesure des évènements de FRET. Cette méthode consiste à mesurer le déclin de fluorescence du donneur au cours du temps. Cela peut être réalisé aussi bien sur des populations de cellules au format microplaque, que par des techniques microscopiques. La base physique de cette approche repose sur le fait que la durée de vie dune molécule fluorescente dépend notamment de lefficacité du processus de FRET. Par conséquent, plus le transfert dénergie entre les deux molécules est efficace plus le déclin de fluorescence du donneur est rapide. Le FLIM (Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy) est un exemple de technologie basée sur lanalyse de durée de vie[13]. Il est préférable avec ce type dapproche dutiliser des molécules fluorescentes dont le déclin de fluorescence est monoexponentiel. La CFP par exemple est utilisée en FLIM en dépit de certains désavantages dus à son faible rendement quantique, son faible coefficient dextinction molaire et surtout à son déclin de fluorescence qui présente deux exponentielles[14]. Ainsi, afin de faciliter lanalyse des durées de vie en FLIM des mutations de cette protéine ont permis de générer un variant nommé Cerulean plus lumineux que la CFP et présentant une décroissance monoexponentielle[15].

Utilisation de la GFP et de ses dérivés en FRET

Figure 3. Les protéines GFP. A. Structure cristallographique de la GFP (code pdb : 1EMB). B. Spectres dexcitation et démission des variants de la GFP.

Linnovation probablement la plus importante dans le domaine des fluorophores fut marquée par la découverte dune protéine fluorescente pouvant être directement encodée à lintérieur de la cellule. Il sagit de la GFP (Green Fluorescent Protein). Lexploitation de la GFP et la génération de variants de cette protéine ont permis le développement de technologies de FRET parfaitement adaptées à létude de la dynamique des interactions moléculaires dans lespace et dans le temps à lintérieur de cellules vivantes.

Initialement identifié chez la méduse Aequorea victoria, le gène codant la GFP a été cloné en 1992 par Prasher et coll. Cristallisée pour la première fois en 1974, il faudra attendre 1996 pour obtenir la structure tridimensionnelle de la GFP par diffraction de rayons X[16]. Cette protéine de 27 kDa se présente sous forme dun cylindre de 30 Å (Ångström) de diamètre et 40 Å de hauteur composé de onze feuillets β (9 à 13 résidus par feuillet) qui entourent une hélice α contenant le chromophore (Figure 2.A). Le chromophore résulte d'une réaction spontanée de cyclisation des chaînes latérales de trois acides aminés (Sérine65Tyrosine66Glycine67) à lintérieur du tonneau. Lorganisation des feuillets β en formant une véritable cage, confère au chromophore son propre environnement[17].

La photoactivation de cette protéine dont le pic dabsorption majoritaire est à 395 nm entraîne une réaction autocatalytique provoquant lémission dune lumière verte avec un pic démission à 508 nm. Différentes protéines mutantes de la GFP ont été produites. En changeant, entre autres, la structure des trois acides aminés formant le chromophore, il a été possible de modifier les longueurs d'onde d'absorption et d'émission de la GFP devenant alors, une BFP (Blue Fluorescent Protein), une YFP (Yellow Fluorescent Protein) ou de nombreux autres variants bien caractérisés (CFP, RFP…) (Figure 3.B). Lutilisation de ces différents mutants comme sondes moléculaires en font des outils de choix aussi bien dans létude de lexpression de gènes, le suivi de protéines et leur compartimentalisation cellulaire que dans lanalyse des interactions protéineprotéine par des approches de transfert dénergie. Concernant ce dernier point, deux paires de fluorophores ont été largement utilisées. Ces molécules BFP/GFP et CFP/YFP dérivées de la GFP présentent en effet des propriétés photophysiques compatibles avec la mise en place dun transfert dénergie.

Le point fort de cette technologie réside dans lencodage des protéines fluorescentes. Il est donc possible de suivre en microscopie la localisation cellulaire des protéines avec une bonne résolution spatiale. De plus, grâce à la forte intensité de fluorescence des molécules utilisées, les phénomènes de transfert dénergie peuvent être visualisés directement dans la cellule permettant de définir à la fois la nature des protéines en interactions, la dynamique de ces phénomènes et leur localisation cellulaire.

Dans le domaine des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) cette approche a été beaucoup utilisée pour caractériser la dimérisation des récepteurs (association par paire des protéines formant un récepteur fonctionnel). La fusion des GFP au niveau de la région carboxy-terminale des récepteurs a permis danalyser leur organisation sans pour autant altérer leur structure, fonction ou localisation dans les travaux publiés. Le principal inconvénient de cette approche pour létude de la dimérisation vient de la nécessité de passer par la microscopie confocale. En effet, en microscopie classique par épifluorescence ou dans un fluorimètre il nest pas possible de séparer le signal provenant des récepteurs de surface de celui des récepteurs retenus dans les compartiments intracellulaires. De plus, la difficulté de miniaturisation de cette approche en microplaque ne permet pas détendre ce type danalyse à du moyen ou haut débit.

Utilisation du BRET

Article principal : BRET.

FRET en temps résolu

Généralités

La principale limite du FRET est liée au manque de sélectivité spectrale des fluorophores utilisés ainsi quà la difficulté de saffranchir des signaux parasites (bruit de fond). Ceci a des conséquences sur la sensibilité des tests mis en œuvre. Ainsi, lutilisation de traceurs présentant des propriétés originales de luminescence a permis de mettre au point des tests plus sensibles en améliorant la résolution spectrale et temporelle du signal de FRET. Ces molécules sont des complexes formés par lassociation dun chromophore (cryptand ou chélate) et dun cation lanthanide faisant partie du groupe des terres rares (europium, terbium…). La principale caractéristique des lanthanides vient de leur durée de vie de luminescence relativement longue (de lordre de la milliseconde). La durée de vie de fluorescence de la plupart des fluorophores organiques et des protéines fluorescentes est de lordre de la nanoseconde, tout comme les fluorescences parasites (autofluorescence, diffraction de la lumière…). Grâce à cette propriété des ions lanthanides, les systèmes de détection de fluorescence en phase homogène et en temps résolu ont pu être développés. Ces systèmes reposent sur lapplication dun délai entre lexcitation de léchantillon et la mesure du signal émis de manière à saffranchir des fluorescences parasites à durée de vie courte. Cette résolution temporelle du signal permet ainsi daméliorer le rapport entre le signal du traceur et le bruit de fond inhérent aux conditions du test sans quaucune étape de séparation des espèces ne soit nécessaire.

Fluorophores

Donneur

Figure 4. Les chélates et cryptates de lanthanide. A. Structure des chélates et cryptates de lanthanide. B. Transfert dénergie entre le chromophore (chélate ou cryptate) et lion europium. C.I.S = croisement intersystème.

Au cours des années 1970, les complexes luminescents de lanthanides se sont révélés des candidats intéressants comme marqueurs dans le développement de systèmes danalyse et de diagnostic. En effet, lutilisation des chélates et cryptates de lanthanides a permis de mettre au point des systèmes de détection en temps résolu caractérisés par une réduction du bruit de fond. Chacune de ces sondes est constituée dun chromophore organique et dun lanthanide (principalement europium et terbium). La complexation de lion par le chélate est basée sur une interaction réversible alors que dans la structure du cryptate, le cryptand encage irréversiblement lion en le protégeant des interactions environnementales (extinction de fluorescence par les molécules deau…) (Figure 4.A). La présence de groupements réactifs au niveau du chromophore permet de greffer le complexe à des biomolécules (anticorps, antigènes, etc.). Une propriété intéressante de ces chromophores est leur capacité à collecter lénergie excitatrice (effet dantenne) et à la transférer sur le cation lanthanide. Lantenne est nécessaire du fait de la faible capacité dabsorption de la lumière par les lanthanides qui rend leur excitation directe difficile (< fluorophores organiques conventionnels). Ainsi, lexcitation du complexe de lanthanide par une lumière incidente (laser, lampe flash…) contribue à peupler les niveaux vibrationnels singulets de haute énergie du chromophore (transition S0S1, S2) (Figure 4.B). Le retour vers létat fondamental S0 est influencé par la présence du lanthanide qui favorise le croisement intersystème permettant de peupler les états triplets (T1) du chromophore. Finalement, le passage T1S0 induit un transfert dénergie favorisant le remplissage des niveaux excités du lanthanide (5D0 pour leuropium et 5D4 pour le terbium) dont la composante de désexcitation par voie radiative est responsable de lémission luminescente.

Le transfert dénergie intramoléculaire existant au sein de ces complexes est responsable du grand déplacement de Stokes (de lordre de 200250 nm) qui permet de saffranchir de linterférence due à la source dexcitation. Ce décalage est la conséquence de la séparation des fonctions absorption (par le chromophore) et émission (par le lanthanide) au sein du complexe. Ainsi, les chromophores organiques (chélate, cryptate) absorbent majoritairement dans lUV et la partie bleue du spectre visible alors que les lanthanides réémettent dans le vertrouge : 560 nm pour le terbium et 605 nm pour leuropium. La longue durée de vie de cette émission (µsms) est principalement la conséquence des transitions électroniques particulières qui interviennent au niveau des terres rares. Cette caractéristique permet dailleurs lutilisation de ces molécules dans des applications en temps résolu.

Dans les milieux biologiques classiquement utilisés, le complexe formé par le chélate et le lanthanide peut être dissocié en raison dune faible stabilité de linteraction (compétition entre lion lanthanide et les ions Mn2+, Mg2+, Ca2+ ou chélation du lanthanide par de lEDTA), ce qui constitue un inconvénient. Dans le cas des cryptates de lanthanides linclusion de leuropium dans une cage tridimensionnelle formée par le cryptand empêche ces phénomènes de dissociation conférant au complexe une très haute stabilité.

Les cryptates de lanthanide sont les donneurs dénergie utilisés dans la technologie HTRF (Homogeneous Time Resolved Fluorescence). La mise au point de leur structure découle des travaux de Jean-Marie Lehn, prix Nobel de chimie en 1987. Plusieurs types de cryptate deuropium ainsi qu'un cryptate de terbium ont été développés par la société CisBio International. Le cryptate de terbium (Lumi4-Tb ) développé récemment par cette société présente plusieurs avantages par rapport aux chélates de terbium et cryptates d'europium. D'abord son coefficient d'extinction molaire, ε = 20,000 M 1cm 1, est deux à trois fois plus important que celui des chélates de terbium, ε = 8,000 M 1cm 1, et cryptates d'europium, ε = 10,000 M 1cm 1. De plus, son large spectre d'absorption rend compatible l'utilisation du Lumi4-Tb avec une large gamme de sources d'excitation (lampes flash, laser au nitrogene etc.).

Accepteur

Les cryptates deuropium sont des fluorophores qui peuvent être utilisés pour des applications de FRET avec des accepteurs d'énergie présentant des propriétés spectrales dans le proche infrarouge comme la Cyanine 5 (Cy5). Deux accepteurs de ce type ont été développés par la société CisBio International.

Le premier accepteur développé pour des tests HTRF est une phycobiliprotéine de 105 kDa, lallophycocyanine purifiée et modifiée chimiquement (XL665) [18],[19]. Cette molécule présente une très bonne compatibilité énergétique avec le cryptate ce qui permet une importante efficacité de transfert[20] (Figure 5). De plus, lémission de la XL665 est maximale à 665 nm alors que lémission du cryptate est très faible dans cette région. Enfin, cette molécule présente un bon rendement quantique (≈ 70%) et peut être couplée à diverses biomolécules par ses groupements amines.

Figure 5. Spectres dabsorption et démission de la XL665. A. Compatibilité énergétique entre le cryptate deuropium TBP et la XL665 (idem d2, Cy5…). B. Spectres démission du cryptate deuropium TBP et de la XL665.

La deuxième génération daccepteurs est représentée par le d2, une petite molécule organique denviron 1 kDa. Comme la XL665, le d2 est un accepteur fortement compatible avec le cryptate deuropium. Dautres molécules très semblables au d2 telles que lAlexaFluor 647 ou le Cy5 sont aussi utilisables dans ce type de tests. La petite taille de ces molécules représente un avantage certain pour des tests biologiques en évitant notamment les problèmes dencombrement stérique.

Le cryptate de terbium, comme le cryptate d'europium, peut être utilisé avec des fluorophores accepteurs d'énergie de type Cy5 mais il présente aussi l'avantage de pouvoir être associé à des accepteurs de type fluorescéine et des protéines fluorescentes (GFP).

Transfert dénergie : sélectivité temporelle et spectrale

La grande sensibilité de détection de la technologie HTRF est la conséquence de lanalyse du signal de FRET en temps résolu (sélectivité temporelle) et dune bonne séparation des spectres démission des molécules donneur et accepteur (sélectivité spectrale).

Sélectivité temporelle

Lors dun transfert dénergie entre un donneur possédant une durée de vie de fluorescence longue et un accepteur fluorescent, ce dernier émettra un signal de fluorescence présentant une durée de vie apparente similaire à celle du donneur[21],[22]. Ainsi, lutilisation des cryptates de terre rare permet de mesurer lémission de fluorescence de laccepteur en temps résolu (intégration du signal après un délai de 50 µs pendant 350 µs) (Figure 6.A). Cette propriété permet de distinguer la fluorescence de laccepteur engagé dans un FRET (durée de vie longue) de la fluorescence de laccepteur libre (durée de vie courte ~ ns) et des fluorescences parasites émises par les biomolécules présentes dans les milieux biologiques (~ ns).

Figure 6. Sélectivité temporelle, sélectivité spectrale et détection à double longueur donde. A. Détection du signal de FRET à 665 nm en temps résolu. B. Spectres démission de leuropium (donneur) et de laccepteur XL665 (ou d2). Le rapport 665/620 permet de saffranchir des interférences optiques entre les différents milieux.

Sélectivité spectrale

La sélectivité spectrale est obtenue grâce à une bonne séparation entre le pic démission de laccepteur et les pics démission du cryptate deuropium. En effet, laccepteur (d2, XL665) émet dans une zone le cryptate német quasiment pas (Figure 6.B).

Détection à double longueur donde

Dans la technologie HTRF, lémission de fluorescence de laccepteur à 665 nm est normalisée par celle du cryptate à 620 nm. Les deux longueurs dondes sont mesurées simultanément. Le calcul du rapport des intensités de fluorescence à 665 et 620 nm permet de saffranchir des variations optiques entre les différents milieux. Dès lors, la valeur de ce rapport ne dépendra que des interactions biologiques (Figure 6.B). Pour le cryptate de terbium deux ratio peuvent être utilisés. Pour le couple Lumi4-Tb/d2 on choisira le ratio 665/620 comme précédemment alors que pour le couple Lumi4-Tb/fluorescéine ce sera le ratio 520/490. La robustesse de ce signal permet par exemple danalyser le FRET dans des milieux biologiques complexes (sérum, cellules…) ou de tester des librairies dont les composés peuvent présenter de fortes absorbances.

Exemples d'application

La sensibilité et la robustesse du signal HTRF font de cette technologie une approche parfaitement adaptée à létude des interactions entre biomolécules dans des systèmes de criblage à haut débit tel qu'il est pratiqué dans l'industrie pharmaceutique. Ainsi, une large variété de tests permettant de détecter de nombreux évènements biologiques a pu être développée. Parmi ces gammes de produits, a été mis au point une série de kits de dosage de seconds messagers permettant de mesurer lactivation des protéines Gs, Gi et Gq couplées à des RCPG[23],[24]. Cette même société a mis en place une nouvelle plateforme de criblage des interactions protéine-protéine à la surface cellulaire. Cette plateforme tire profit de l'utilisation de ligands fluorescents[25] ainsi que de la technologie SNAP-tag [26] pour cibler spécifiquement des protéines d'intérêt (RCPG) avec des fluorophores donneur/accepteur, permettant une analyse des interactions protéine-protéine par FRET en temps résolu.

Transfert dénergie intermoléculaire

Les techniques de transfert dénergie, FRET (variants de la GFP, anticorps marqués…) ou BRET, ont été beaucoup utilisées pour démontrer des interactions protéinesprotéines aussi bien à lintérieur de la cellule quà la surface cellulaire. Quelle que soit la méthode choisie, cette démonstration repose sur la détection dun signal caractéristique reflétant la forte proximité, si ce nest lassociation, des protéines cibles. Dans le domaine des récepteurs couplés aux protéines G, ces approches ont révélé lexistence de récepteurs membranaires homo- ou hétérodimériques et ont contribué à mieux comprendre les mécanismes intervenant au cours de lactivation des protéines G. Elles ont aussi permis de développer, entre autres, des sondes sensibles à des seconds messagers comme par exemple lAMPc[27]. En effet, lAMPc en se fixant au niveau des sous-unités catalytiques et régulatrices de la PKA, entraîne une dissociation de ce complexe. Ainsi, en fusionnant les fluorophores au niveau des différentes sous-unités, il est possible de corréler directement la production dAMPc intracellulaire à une diminution du signal de FRET.

Transfert dénergie intramoléculaire (changements conformationnels)

Figure 7. Transfert dénergie intramoléculaire : sonde calcique[28].

Les techniques de transfert dénergie sont des approches suffisamment sensibles pour mesurer des changements conformationnels intervenant au sein dune protéine. Ceci est possible en incorporant les fluorophores donneur et accepteur à différentes positions de la protéine dintérêt. Les points dinsertion sont choisis de manière à ce que les changements conformationnels, en modifiant la distance et/ou lorientation des fluorophores, entraînent des modifications du transfert dénergie (augmentation ou diminution).

Le transfert dénergie intramoléculaire a permis danalyser les changements conformationnels intervenant au cours des processus dactivation des récepteurs membranaires. Ainsi, Vilardaga et coll. ont analysé les réarrangements intracellulaires induits par la fixation de molécules agonistes et antagonistes au niveau des récepteurs béta-2A-adrénergiques et des récepteurs aux hormones parathyroïdiennes[29]. Le même type danalyse a permis détudier les changements conformationnels du récepteur aux androgènes[30].

De nombreuses sondes intracellulaires ont aussi été développées sur ce principe. Lobjectif de ces systèmes est de pouvoir révéler lactivation dune voie de signalisation particulière en mesurant les variations de concentrations de différents seconds messagers. La première sonde fluorescente appelée caméléon, a été développée par Miyawaki et coll. afin de mesurer les modifications de la concentration calcique à lintérieur de la cellule[7] (Figure 7). Suite à la fixation de quatre ions calcium au niveau de son domaine calmoduline, la sonde subit des changements conformationnels provoquant un rapprochement des fluorophores. Laugmentation du signal de FRET à 510 (GFP) ou 535 nm (YFP) est dépendante de la production calcique intracellulaire. Il est ainsi possible de mesurer en temps réel, les variations de la concentration calcique à lintérieur de la cellule. Dautres sondes ont aussi été développées pour mesurer notamment la concentration en GMPc (Nikolaev et al., 2006) ou pour détecter simultanément lactivité de la PKA et de la PKC[31].

Notes et références

  1. Selvin, 2000
  2. a et b Stryer, 1978
  3. Stryer and Haugland, 1967
  4. Dale et al., 1979
  5. Sokol et al., 1998
  6. Chan et al., 1979
  7. a et b Miyawaki et al., 1997
  8. Zheng et al., 2002
  9. Rocheville et al., 2000
  10. Gregan et al., 2004
  11. He et al., 2003
  12. Valentin G et al., 2005
  13. Bastiaens and Squire, 1999
  14. Tramier et al., 2002
  15. Rizzo et al., 2004
  16. Ormo et al., 1996
  17. Ward, 2006
  18. Mathis, 1993
  19. Trinquet et al., 2001
  20. Bazin et al., 2002
  21. Mathis, 1995
  22. Morrison, 1988
  23. Gabriel et al., 2003
  24. Trinquet et al., 2006
  25. Albizu et al., 2010
  26. Maurel et al., 2008
  27. Zaccolo et al., 2000
  28. Daprès Miyawaki et al., 1997
  29. Vilardaga et al., 2003
  30. Schaufele et al., 2005
  31. Brumbaugh et al., 2006

Voir aussi

Bibliographie

  • (en) J. R. Lakowitz, Principles of fluorescence spectroscopy, 2ème édition, Kluwer Academic/Plenum publisher.

Articles connexes


Wikimedia Foundation. 2010.

Contenu soumis à la licence CC-BY-SA. Source : Article Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes de Wikipédia en français (auteurs)

Игры ⚽ Поможем сделать НИР

Regardez d'autres dictionnaires:

  • Transfert d'energie entre molecules fluorescentes — Transfert d énergie entre molécules fluorescentes Pour les articles homonymes, voir Fret (homonymie). Sommaire 1 Introduction 2 Conditions du transfert d’énergie …   Wikipédia en Français

  • FRET — Transfert d énergie entre molécules fluorescentes Pour les articles homonymes, voir Fret (homonymie). Sommaire 1 Introduction 2 Conditions du transfert d’énergie …   Wikipédia en Français

  • FRET (Physique) — Transfert d énergie entre molécules fluorescentes Pour les articles homonymes, voir Fret (homonymie). Sommaire 1 Introduction 2 Conditions du transfert d’énergie …   Wikipédia en Français

  • Diagramme de Jablonski — Un diagramme de Jablonski représentant le transfert d énergie entre molécules fluorescentes. Un Diagramme de Jablonski, nommé d après le physicien polonais Alexandre Jablonski, est un diagramme représentant les états électroniques d une molécule… …   Wikipédia en Français

  • Liste de sigles de biologie cellulaire et moléculaire — Sommaire : Haut A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z A ACP : amplification en chaîne par polymérase (ou réaction en chaîne par polymérase), méthode de …   Wikipédia en Français

  • Fret (Homonymie) — Cette page d’homonymie répertorie les différents sujets et articles partageant un même nom. Le Fret se rapporte au transport de marchandise. En physique, et appliquée en biologie moléculaire, l acronyme anglais FRET désigne le Transfert d énergie …   Wikipédia en Français

  • Fret (homonymie) — Cette page d’homonymie répertorie les différents sujets et articles partageant un même nom. Le Fret se rapporte au transport de marchandise. En physique, et appliquée en biologie moléculaire, l acronyme anglais FRET désigne le Transfert d énergie …   Wikipédia en Français

  • Photoblanchiment — Le photoblanchiment est la perte de fluorescence d une molécule. Une molécule fluorescente à l état excitée peut soit émettre un photon, soit être engagée dans une réaction photochimique qui va empêcher son retour à un état excitable. Il peut s… …   Wikipédia en Français

  • CHLOROPHYLLES — Le nom de chlorophylle a été donné en 1818 par P. J. Pelletier et J. B. Caventou aux pigments verts des feuilles. Trente ans plus tard environ, leur parenté chimique avec les pigments sanguins fut soupçonnée, puis la diversité des chlorophylles… …   Encyclopédie Universelle

  • MICROSCOPIE — La révolution qui consiste, à la fin du XVIe siècle, à regarder «à la loupe» non plus directement un objet, mais son image agrandie est à l’origine de la microscopie. L’étymologie (du grec mikros , petit, et skopein , examiner) renvoie à l’examen …   Encyclopédie Universelle

Share the article and excerpts

Direct link
https://fr-academic.com/dic.nsf/frwiki/1655857 Do a right-click on the link above
and select “Copy Link”