- Synthèse d'oligonucléotide
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La synthèse d'oligonucléotide est la synthèse chimique de fragments relativement courts d'acide nucléique avec une structure définie.
Sommaire
Principe
La technique est largement utilisée dans les laboratoires. Elle permet d'obtenir un accès inédit ou peu couteux à des oligonucléotides avec la séquence de nucléotides désirée. Le procédé utilise comme building block des nucléosides de type désoxyadénosine (dA), la désoxythymidine (dT), la désoxycytidine (dC) et la désoxyguanosine (G) pour l'ADN et de type adénosine (A), la thymidine (T), la cytidine (C) et la guanosine (G) pour l'ARN sous forme de phosphoramidite. La technique de départ a pour point de départ un support solide sur lequel est greffé le premier nucléotide. Une fois la synthèse terminée, l'oligonucléotide va être séparé du support solide par un clivage chimique.
Pour obtenir l'oligonucléotide désiré, la synthèse s'effectue selon plusieurs cycles de synthèse. À chaque cycle, un nucléotide est incorporé sur la chaine oligonucléotidique en croissance. Alors que les enzymes effectuent la synthèse de l'ADN ou de l'ARN dans le sens 5' vers 3', la synthèse chimique des oligonucléotides s'effectue dans le sens 3' vers 5'. Depuis la fin des années 70 le processus est réalisé de manière automatisée par un synthétiseur. Les produits sont souvent purifiés par HPLC pour obtenir l'oligonucléotide en plus grande pureté. Généralement, les oligonucléotides synthétisés ont une longueur d'environ 15-25 nucléotides et sont utilisés comme oligonucléotides antisens, small interfering ARN, sondes pour détecter les mutations de l'ADN ou l'ARN par hybridation, ou comme primers dans le séquencage et l'amplification de l'ADN.
Histoire
Synthèse à l'aide de phosphodiester
La première synthèse d'ADN a été mise au point par H Gobind Khorana dans les années 1960. Les réactions s'effectuent en solution et chaque produit doit être isolé avant de passer à l'étape suivante. Khorana a utilisé cette méthode en combinaison avec des méthodes enzymatiques et a réussi à synthétiser un ARN de 126 nucléotides.
Synthèse à l'aide de phosphotriester
Synthèse à l'aide de phosphite triester
Cycle de synthèse
Cycle de synthèse par la méthode des phosphoramidites
- La déprotection
Tout d'abord le groupement protecteur de l'hydroxyle en 5' est clivé à l'aide d'une solution d'acide trichloroacétique. Ce groupement diméthoxytrityl a une couleur orange une fois libéré. L'efficacité de chaque cycle de couplage peut être évaluée en effectuant un dosage UV des solutions trityle. Pour cette raison, la solution de diméthoxytril est collectée.
- Le couplage
Le phosphoramidite protégé par un groupement cyanoéthyle est introduit et réagit avec l'hydroxyle en 5' qui vient d'être déprotégé. Le couplage s'effectue en présence de tétrazole, un acide faible servant d'activateur pour permettre le couplage et la formation d'un phosphite triester.
- Le cappage
Le couplage à chaque étape de synthèse n'est jamais totale et certains hydroxyles en 5' vont rester libres. Pour éviter la formation d'oligonucléotides tronqués, de l'acide acétique est utilisé afin d'acétyler les hydroxyles libres et de les empêcher de réagir lors des cycles suivant de synthèse. En effet, les oligonucléotides acétylés seront plus faciles à séparer que des oligonucléotides tronqués.
- L'oxydation
La liaison phosphite synthétisée à l'étape de couplage est instable. Une étape d'oxydation permet d'obtenir une liaison phosphate diester. Une solution de diiode dans du tetrahydrofurane permet de donner un atome d'oxygène. La réaction d'oxydation est rapide et termine le cycle de synthèse.
Traitement après synthèse
Le rendement de couplage moyen à chaque cycle est de l'ordre de 98-99%. Le dosage des solutions de diméthoxytriltyle permet d'obtenir le rendement exacte de chaque étape ; il est effectué de façon automatique par le synthétiseur. Une étape de purification doit avoir lieu après la synthèse. Le premier but de la purification est d'éliminer les groupements de protections et l'ammoniaque utilisé pendant la déprotection et le clivage de l'oligonucléotide. Par ailleurs, une quantité non négligeable d'oligonucléotides tronqués a été formée lors de la synthèse et doit être éliminée.
Synthèse d'oligonucléotides modifiés
Plusieurs procédes permettent d'introduire des nucléotides modifiés dans un oligonucléotide
- L'incorporation peut s'effectuer au cours de la synthèses automatisée. Le nucléotide peut donc être présent au milieu de la séquence ou en position 5'.
- Le nucléotide modifié peut être en position 3' en utilisant un support solide modifié.
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