- Denaturing High Performance Liquid Chromatography
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La Denaturing High Performance Liquid Chromatography (DHPLC) est une méthode chromatographique permettant la détection de substitutions de bases, de petites délétions ou d'insertions au niveau de l'ADN. Grâce à sa rapidité et sa résolution élevées, cette méthode est particulièrement utile pour la recherche de polymorphismes dans l'ADN.
En pratique, l'analyse commence par une PCR classique afin d'amplifier le fragment étudié. Si la région amplifiée présente un polymorphisme hémizygote, deux types de fragments, correspondant à l'allèle sauvage et à l'allèle polymorphe, seront présents dans le produit de PCR. Cette première étape est suivie d'une étape de dénaturation - renaturation afin de créer des hétéro- et homoduplexes à partir des deux populations présentes dans la PCR. Pour rechercher un polymorphisme homozygote, il faut procéder de la même manière en mélangeant au préalable une population d'ADN sauvage à une population d'ADN polymorphe pour obtenir des hétéroduplexes après l'étape de dénaturation - renaturation.
Les hétéroduplexes sont en fait des doubles brins d'ADN formés d'un brin venant de l'allèle sauvage et d'un brin issu de l'allèle polymorphe. La formation de tels fragments d'ADN entraîne alors l'apparition d'un « mismatch » ou mauvais appariement à l'endroit où est localisé le polymorphisme.
Ces « mismatches » présents au niveau des hétéroduplexes sont à la base de la détection de polymorphismes par la DHPLC. En effet, les hétéroduplexes, thermiquement moins stables que leurs homoduplexes correspondants, seront résolus grâce à la chromatographie lorsqu'ils seront soumis à une température suffisamment élevée. La conséquence de cette instabilité sera un désappariement des deux brins d'ADN dans la région du polymorphisme lorsque l'ADN sera chauffé à température adéquate. Ce désappariement entraînera dès lors une diminution de l'interaction avec la colonne et donc un temps de rétention réduit par rapport aux homoduplexes lors de la séparation chromatographique.Pour observer ce phénomène de séparation, la DHPLC utilise une colonne greffée d'une phase stationnaire non poreuse composée de poly(styrène-divinylbenzène) alkylé. Cette phase stationnaire est électriquement neutre et hydrophobe. L'ADN, lui, est chargé négativement au niveau de ses groupements phosphates et ne peut donc s'adsorber de lui-même au niveau de la colonne. Afin de rendre l'adsorption possible, on utilise de l'acétate de triéthylammonium (TEAA). Les ions ammonium chargés positivement de ces molécules interagissent avec l'ADN et les chaînes alkyl, avec la surface hydrophobe de la phase solide.
Ainsi, lorsque les hétéroduplexes sont partiellement dénaturés par chauffage, des charges négatives subissent une délocalisation partielle et la force d'interaction entre l'ADN des hétéroduplexes et la colonne diminue en comparaison à la force d'interaction des homoduplexes. Ces derniers seront alors élués moins rapidement par la phase mobile, composée d'acétonitrile, par rapport aux hétéroduplexes qui passeront alors les premiers devant le détecteur UV (Ultraviolet) .
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