Centrifugation Analytique

La centrifugation analytique est une méthode d’analyse des macromolécules en solution donnant des informations sur leur masse, leur taille, leur forme et leur composition. Deux types d’expériences existent : la vitesse de sédimentation et l’équilibre de sédimentation.

Instrumentation

Lors de la centrifugation, on mesure à une longueur d'onde donnée l'absorbance de l'échantillon en fonction de la distance à l'axe de rotation. On obtient donc la répartition du matériel (exprimé en absorbance) dans la cellule de centrifugation en fonction de la distance radiale et (éventuellement) du temps.

Vitesse de sédimentation

Principe

Lorsque l'on centrifuge une macromolécule avec une grande vitesse angulaire (par rapport à sa capacité à sédimenter), la macromolécule est entraînée vers l'extérieur, elle culotte. Durant l'expérience, on observe à différents temps l’absorbance en fonction de la distance à l'axe de rotation: un front se forme et se déplace vers le fond de la cellule.

La position de ce front en fonction du temps permet de calculer le coefficient de sédimentation, s, caractérisant la particule dans son milieu. s est le rapport entre vitesse de la particule (v) et accélération due à la force centrifuge (ω²r, où ω est la vitesse angulaire et r la distance à l'axe de rotation). Dans le cas d'un système interagissant, on peut obtenir un ou plusieurs fronts. Les coefficients de sédimentation mesurés correspondent, dans le premier cas, à la moyenne en poids des coefficients de sédimentation des espèces individuelles, et leurs valeurs dépendront non seulement des caractéristiques des espèces individuelles et de leur constante d'association, mais aussi des vitesses relatives d'association et de séparation d’espèces.

Equation

s est exprimé en Svedberg, par la relation suivante (pour un soluté homogène, idéal dans un solvant) : s = M(1 − ρV) / Nf

La valeur du coefficient de sédimentation va dépendre du poids moléculaire M de la macromolécule, mais aussi du terme (1 − ρV) qui exprime la différence de densité entre la macromolécule et le solvant, puisque ρ est la densité du solvant et V le volume partiel spécifique de la macromolécule, soit l'inverse de sa densité ; s dépend aussi du nombre d’Avogadro N, du coefficient de friction f, donc de la forme de la macromolécule et de la viscosité h du solvant. Les coefficients de sédimentation sont généralement exprimés corrigés par la viscosité et la densité du solvant par S_20,w, le coefficient qu'aurait la particule si la mesure avait été effectuée dans l'eau, à 20°C. Le S_20,w dépend néanmoins de trois paramètres macromoléculaires, la masse, le volume partiel spécifique et la forme. Pour interpréter S_20,w, le volume partiel spécifique de la protéine est calculé à partir de la composition en acides aminés de la protéine.

Dans le cas d’un échantillon homogène sans interaction, l’analyse de l’élargissement du front permet d’obtenir f, le coefficient de friction, et donc de calculer M, le poids moléculaire.

Interêt de la technique

Les expériences de vitesse de sédimentation sont extrêmement utiles car rapides (entre 1 et 3 heures) et visuelles, puisque l'on sépare les espèces. Elles permettent de détecter des hétérogénéités, de mettre en évidence des phénomènes de dissociation ou d'association, des tendances à l’attraction ou à la répulsion, et dans certains cas de déterminer les poids moléculaires.

• Portail de la biochimie