Cytométrie en flux

La cytométrie en flux (CMF) est une technique permettant de faire défiler des particules, molécules ou cellules à grande vitesse dans le faisceau d'un laser, en les comptant et en les caractérisant.

C'est la lumière réémise (par diffusion ou fluorescence) qui permet de classer la population suivant plusieurs critères et de les trier.

La cytométrie en flux est définie comme l’étude précise de particules isolées ou de cellules, bactéries, etc. (vivantes ou mortes) entraînées par un flux liquide ou gazeux. C’est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide.

Principe

Il s'agit d'analyser les signaux optiques ou physiques émis par une particule coupant le faisceau lumineux d’un laser ou d’une lampe à arc.
Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs :

• aux propriétés optiques intrinsèques des particules ; ils correspondent aux phénomènes de diffusion lumineuse liés aux dimensions de la particule, à leur structure interne ou à l’auto-fluorescence de certaines cellules comme les végétaux, le phytoplancton, etc.
• aux propriétés optiques induites de fluorescence obtenues par des marquages spécifiques de structures ou de fonctions cellulaires.

Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photo-multiplicateurs (PMT), amplifiés, numérisés, traités et stockés par un ordinateur par l'intermédiaire d'une composante informatique et optique (miroir dichroïque et filtre optique).

Ce procédé d’analyse individuelle (cellule par cellule) est multiparamétrique et peut s’effectuer à la vitesse de plusieurs milliers d’événements par seconde. L’ordinateur calcule les données statistiques associées aux distributions des paramètres mesurés et les représente sous la forme d’histogrammes (un paramètre) ou de cytogrammes (deux paramètres) sur une ou plusieurs populations dont les propriétés cellulaires sont ainsi évaluées.

La fonction tri des cytomètres en flux les plus évolués permet de trier physiquement une ou deux populations cellulaires définies par leurs propriétés optiques.

Histoire et prospective

Les premiers cytomètres en flux ont été inventés dans les années 1950.

• 1934 : Premier article traitant de la cytométrie en flux, publié dans Science par Moldovan. Il y explique le comptage de cellules circulant dans un tube capillaire devant un détecteur photoélectrique.
• 1941 : Utilisation d'anticorps couplés à une molécule fluorescente (fluorochrome), l'anthracène, pour détecter des pneumocoques^[1]
• 1972 : Création de l'appareil nommé FACS (triage de sous population)
• 1994 : commercialisation du premier trieur de cellule à haute vitesse
• 2006 : Une vingtaine de sociétés commercialisent des appareils de chromatographie de flux, certains sont capables d'analyser les cellules à la vitesse de 100,000 évènements par seconde.

C'est un des domaines d'intérêt de l'analyse biologique et plus largement de l'évaluation environnementale.
On espère pouvoir un jour assurer ainsi un monitoring automatisé de la qualité de l'eau, et de ses variations par le suivi de bioindicateurs

Signaux recueillis

Les signaux optiques recueillis ont une intensité corrélée avec les propriétés particulaires.

Lumière diffusée

La lumière diffusée renseigne sur la morphologie et la structure de la particule. Si la diffusion de la lumière est mesurée dans l’axe du rayon incident, l’intensité du signal peut être corrélée avec la taille et la viabilité cellulaire.

Sous un angle de 90°, la mesure correspond à la structure intracellulaire de la cellule (réfringence du cytoplasme, granulosité, morphologie, rapport nucléo-cytoplasmique).

L’utilisation simultanée de ces deux paramètres permet de distinguer, dans un sang périphérique par exemple, les plaquettes, les lymphocytes, les monocytes et les polynucléaires.

Lumière absorbée

Cette mesure évolue proportionnellement au diamètre de la cellule (supposée sphérique) et à l’indice d’absorption des constituants bio-intra post cellulaires.

Fluorescence émise

Cette fluorescence peut être spontanée, mais le plus souvent, elle est apportée à la cellule par un fluorochrome. Le fluorochrome absorbe l’énergie du laser et réémet l’énergie absorbée sous forme de photons d’une longueur d’onde plus élevée :

• fluorochromes à affinité propre pour un constituant cellulaire : par exemple pour les mesures d’ADN, d’ARN, de protéines, du pH, de calcium contenus dans la cellule ;
• fluorochromes couplés à un ligand spécifique. Cette spécificité peut être amenée par un couplage du fluorochrome à un anticorps ou un ligand spécifique supercopter d’un constituant cellulaire.
• tandem de fluorochromes, deux fluorochromes couplés à un anticorps, permet d'utiliser un fluorochrome qui ne serait normalement pas excité pour un laser donné. Le premier fluorochrome est donc excité par un laser, l'émission de longueur d'onde se trouvant dans le spectre d'absorption du second, excite à son tour le deuxième fluorochrome qui émet donc sa propre longueur d'onde.

Principales applications

Utilisation de la cytométrie en flux en océanographie

L’hématologie a été l’une des premières disciplines médicales à bénéficier des applications cliniques de la cytométrie en flux. Certaines de ces applications sont maintenant utilisées régulièrement pour le diagnostic ou le suivi thérapeutique de différentes affections. Ces applications concernent aussi bien l’étude fonctionnelle de cellules saines que la mise en évidence du caractère pathologique des cellules analysées.

En cancérologie, la détection de la cellule pathologique est l’application la plus développée. Cette détection repose essentiellement sur la mesure d’un contenu anormal d’ADN dans le noyau de la cellule tumorale.

L'immunologie utilise la CMF pour la détection ou l'identification des sous-types des cellules impliquées dans l'immunité.

Le cycle cellulaire représente l’intégralité de la période de division, c’est-à-dire l’ensemble des événements biochimiques et morphologiques qui sont responsables de la prolifération cellulaire. La CMF offre une méthodologie rapide et simple à mettre en œuvre pour l’analyse du cycle cellulaire. Elle permet de suivre la distribution des cellules dans les différentes phases du cycle en fonction de divers stimulus ou de l’ajout de certaines drogues. Elle permet aussi de voir la présence de cellules avec des contenus anormaux d’ADN.

De nombreuses études en pharmacologie font aussi appel à des techniques de CMF : mise au point ou étude de drogues antimitotiques, immunothérapie.

En océanologie, la cytométrie en flux est devenue une méthode de routine pour compter les différents populations du picoplancton photosynthétique sur la base de la fluorescence des pigments tel que la chlorophylle. Après marquage des échantillons avec des marqueurs de l'ADN tels que le SYBR-Green, on peut aussi énumérer bactéries et virus.

D’autres recherches font appel à la CMF : l’analyse des chromosomes, la physiologie végétale (ploïdie, contenu en ADN, pour la sélection des plantes les plus résistantes), etc.

Notes et références

Liens externes

• The International Society for Analytical Cytometry
• Purdue University - Cytometry Laboratory, un site avec beaucoup d'informations détaillées

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