Protéine recombinante

Protéine recombinante

Une protéine recombinante (ou protéine hétérologue[1]) est une protéine produite par une cellule dont le matériel génétique a été modifié par recombinaison génétique. Un gène codant une protéine dintérêt est introduit dans le génome de lespèce productrice (bactéries, cellules mammifères en culture, animaux transgéniques, etc.). Les protéines recombinantes peuvent être purifiées et utilisées à des fins thérapeutiques, industrielles ou bien encore dans les activités de recherche.

Sommaire

Historique

[11]

Cest en 1972 que les premières manipulations in vitro sur gènes ont commencé. A cette époque, le biochimiste Paul Berg obtient le premier ADN recombinant grâce aux enzymes de restriction. Un an plus tard, S.Cohen et H. Boyer parviennent à introduire des gènes damphibien dans la bactérie Escherichia coli. Le premier organisme transgénique est . Dans les années 80, le premier produit issu du génie génétique est commercialisé. Il sagit de linsuline recombinante humaine produite par des bactéries génétiquement modifiées. Cest aussi à cette période que les scientifiques se rendent compte que toutes les protéines produites par cette méthode ne sont pas fonctionnelles. Ce problème vient du fait que les bactéries nont pas toute la machinerie qui permet aux protéines davoir leur maturation post-traductionnelle et donc dacquérir une activité biologique. Les chercheurs se tournent alors vers des modèles de cellules eucaryotes. En 1982, la première souris transgénique voit le jour. Elle produit une quantité dhormone plus grande que la normale.

Construction du transgène

[3];[12];[14];[16]

Composition du transgène

  • Le vecteur est un moyen de transport de lADN. Cest un fragment capable de réplication autonome et qui peut supporter linsertion dun autre fragment dADN de taille variable (plasmide bactérien).
  • Lorganisme donneur exprime la protéine dintérêt. LARNm codant cette protéine est isolé de cet organisme. LARNm permet la synthèse de lADNc qui sera utilisé pour le clonage. En effet, lADN génomique eucaryote nest pas utilisable dans un système bactérien car les bactéries ne possèdent pas la machinerie dépissage des ARNm eucaryotes.

Cest pourquoi la technique RT-PCR est souvent utilisée pour lobtention de lADNc codant le gène dintérêt. Suite à la réverse transcription des ARNm totaux en ARNm, lADNc correspondant à lARNm codant la protéine dintérêt est amplifié par PCR en utilisant des amorces spécifiques auxquels sont ajoutés des sites de restrictions qui seront ensuite utilisés pour le clonage.

  • Séquences régulatrices

Une fois lADNc dintérêt amplifié, il lui faut ajouter les séquences permettant de cibler le tissu de transcription ainsi que les signaux de terminaison de la transcription et de la traduction. Ces séquences sont souvent présentes sur le plasmide dans lequel est cloné le gène dintérêt :

  • - En 5’ : un promoteur spécifique du tissu dans lequel lexpression est attendue, ainsi quun intron dans le cas ou la transgenèse est réalisée en modèle eucaryote.
  • En 3’ : un codon stop ainsi quun signal de polyadénylation.
Compotransgéne.JPG

Avec les bactéries il ny a pas besoin dintrons.

Clonage du gène d'intérêt

ADN recombinant :

LADNc amplifié par PCR est cloné dans un vecteur (chromosome artificiel bactérien, chromosome artificiel de levure, plasmide bactérien, etc.) contenant les séquences régulatrices décrites précédemment.

Pour cela, le vecteur (ici plasmide) ainsi que lADNc du gène dintérêt sont digérés par des enzymes de restriction différentes afin dorienter linsertion de lADNc avant de liguer lADNc dans le plasmide à laide dune ligase.

ADN recombinant3.JPG

Le plasmide recombinant est ensuite introduit dans une bactérie, par transformation, afin damplifier le vecteur qui sera ensuite purifié. Avant de réaliser la transgenèse, le vecteur est linéarisé et les signaux de réplication bactériens ainsi que les gènes de résistances présents sur le plasmide sont éliminés par utilisation denzymes de restriction.

Transgenèse et animaux fondateurs

[2];[5];[10];[14];[17]

Transgenèse

Cest une technique consistant à lintégration dun gène exogène au génome dun organisme hôte. Le but de cette manipulation est de permettre à lhôte de produire une protéine dintérêt non produite par une espèce donnée ou bien de le produire en plus grande quantité (utilisé dans les activités de recherche)[2].

Choix de l'hôte

Il se fera en fonction de lutilisation désirée de la protéine recombinante ainsi que des mécanismes cellulaires nécessaires à la production dune protéine fonctionnelle :

  • Bactéries : forte croissance, niveau de sécrétion variable mais pas de modification post-traductionnelle. Formation de corps dinclusion si la protéine nest pas sécrétée.
  • Levures : faciles à cultiver, modifications post-traductionnelles, bonne expression mais faible capacité de sécrétion des grosses protéines.
  • Champignons : bonne sécrétion, modifications post-traductionnelles mais parfois indésirables.
  • Cellules de mammifères : production de grosses molécules possible mais faible rendement pour des couts élevés.
  • Plantes : Utilisées dans le cas de productions de plantes transgéniques OGM permettant une résistance à des parasites ou à des pesticides. Ex : Maïs Bt
  • Animaux : productions de grosses molécules, possibilité de consommer les protéines recombinantes dans lalimentation, nécessite de grande structure pour lélevage.

Introduction du gène dintérêt dans le génome hôte

  • Pour les bactéries et les levures, le transgène sera soit introduit dans la cellule sur un plasmide, soit intégré au génome bactérien par double recombinaison homologue.
  • Chez les végétaux, lintégration de lADN recombinant se fait grâce à un « canon à ADN », qui projette des microbilles d'or ou de tungstène enrobées d'ADN ou par lutilisation de bactéries capables de transférer de lADN à sa cellule hôte (ex : Agrobactérium tumefasciens)
  • Pour les animaux, linjection dune solution contenant lADN recombinant sous forme linéaire est injecté dans le pronucléus mâle dune cellule œuf avant létape de caryogamie. LADN injecté sera intégré au génome par les mécanismes de réparation de lADN de la cellule hôte. La drosophile, le poisson zèbre, le vers nématode, le poulet, le Xénope, la souris sont des animaux très utilisés.

Exemple de transgenèse en modèle murin :

Schéma3.jpg

LADN exogène est injecté dans le pronucleus mâle

  1. Les œufs viables sont réimplantés dans une mère porteuse préparée à recevoir un embryon
  2. Chez la souris porteuse, lADN injecté est intégré à lADN hôte par les mécanismes de réparation de lADN. Les souris transgéniques sont identifiées par PCR.
  3. Croisement entre des souris sauvages et les souris transgéniques permet dobtenir des souris hétérozygotes pour le transgène.
  4. Si nécessaire, un croisement entre deux souris hétérozygotes permet dobtenir des souris homozygotes pour le transgène.

Suite à sa production la protéine est purifiée grâce à des méthodes biochimiques comme la chromatographie sur colonne, HPLC, …

Problèmes fréquents

Il est possible que le nombre de copie du transgène intégré soit insuffisant pour permettre une production de protéine dintérêt en concentration satisfaisante pour son utilisation à grande échelle. Au contraire, lexpression du gène transféré peut être muette. En effet, si ce dernier sest intégré au niveau dune région dhétérochromatine, le gène ne se verra pas transcrit et donc pas exprimé. Lintégration du transgène peut également avoir des conséquences néfastes sur le développement de lorganisme hôte:

- Par un changement de besoin nutritionnel

- Lexpression du transgène dans une zone non ciblée créant des traumatismes des tissus (expression ectopique)

- Une surproduction du transgène menant à un phénotype délétère

- Le blocage de lexpression dun gène endogène si lintégration sest faite à lintérieur de ce gène

Schématisationtrans.JPG

Exemple de l'antithrombine III recombinante

[15];[7];[9];[8];[4]

L'antithrombine III est une protéine produite au niveau du foie et de cellules endothéliales chez lhomme. Son rôle est dempêcher la formation de caillots sanguins dans les veines et les artères. La diminution des taux d'antithrombine III entraîne un risque de maladie thrombo-embolique. Les déficiences en antithrombine peuvent venir de problèmes congénitaux ou être acquises au cours de la vie. De nos jours, avec les progrès de la science, il est possible de la synthétiser grâce au génie génétique.

Comment obtenir lantithrombine III avec le génie génétique ?

Dans un premier temps, il faut choisir un promoteur actif dans les tissus ou les glandes dans lesquelles nous souhaitons récupérer la protéine recombinante (ici, le lait de chèvre). Ce promoteur doit être cloné. Pour que la protéine soit bien présente dans le lait, il faut que la séquence dADN introduite soit composée :

  • Dun promoteur actif dans les glandes mammaires.
  • Du gène codant pour la protéine dintérêt
  • Dun signal de polyadénylation
  • Pour que lantithrombine soit sécrétée dans le lait, il est aussi nécessaire dintroduire une séquence signal dexcrétion.

Une fois cette étape terminée, la transgenèse est réalisée comme décrit précédemment. Enfin la protéine est purifiée puis commercialisée (par exemple, sous le nom dATryn®).

Cette technique permet dobtenir des quantités dantithrombine beaucoup plus importantes que dans le sang humain.

Comment est administré le traitement ?

Il existe deux façons d'administrer cette substance :

  • Par voie intraveineuse
  • Sous forme de comprimés.

Notes et références

  1. Glossaire de la biotechnologie pour l'alimentation et l'agriculture, www.fao.org, consulté le 7 janvier 2011.]
  2. Louis Marie HOUDEBINE, “transgenic animal bioreactors”, 2000 Transgenic research 9.

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