Immunofluorescence

Immunofluorescence

Limmunofluorescence est une technique dimmunomarquage, qui utilise des anticorps (ou immunoglobulines) ainsi que des fluorochromes.

Sommaire

Historique

Le phénomène de fluorescence fut découvert au milieu du 19° siècle par le scientifique anglais Sir George Gabriel Stokes. Il fut le premier à faire l'observation que la fluorine (un minéral), émettait de la fluorescence quand il était soumis à des rayons ultra-violet, et il lui donna le nom de "fluorescence".

Principes de l'immunofluorescence[1],[2],[3].

Il existe deux types de fluorescence. Tout dabord, la fluorescence dite « naturelle », ou auto-fluorescence, émise spontanément par la cellule. On peut citer par exemple la chlorophylle des cellules végétales. Ensuite il y a la fluorescence conférée par un fluorochrome, substance chimique qui émet de la lumière si elle est excitée à une certaine longueur donde.

Immunofluorescence directe

En immunofluorescence, on peut réaliser deux types de marquages. Le premier est limmunofluorescence directe. Lors de ce marquage, on utilise un anticorps dirigé contre la molécule recherchée, appelée antigène. Cet anticorps est couplé à un fluorochrome. Ensuite pour révéler la préparation, on peut utiliser un microscope à épifluorescence ou un microscope confocal.

Immunofluorescence indirecte

C'est le second marquage. Dans ce cas, on a deux anticorps. Lanticorps primaire est dirigé contre lantigène recherché. Ensuite on utilise un deuxième anticorps, marqué par un fluorochrome, et possédant une haute affinité pour lanticorps primaire (dirigé contre lisotype de lanticorps primaire, il s'agit alors d'une antiglobuline.)

Avantages et inconvénients

Comme avantages, il y a la possibilité de réaliser des marquages multiples sur un même échantillon de cellules, la rapidité et la facilité d'utilisation de cette méthode et aussi une bonne fiabilité de celle-ci. De plus en immunofluorescence indirecte, on a une augmentation de lintensité lumineuse, car il y a plusieurs sites de fixation sur les anticorps primaires, ce qui permet davoir plusieurs anticorps secondaires fixés dessus.

Mais ils y a quelques inconvénients. Par exemple, la possibilité de réaction faussement positives ou faussement négatives, l'appréciation subjective du degré de fluorescence et le phénomène de photo-blanchiment. Pour pallier ces inconvénients, il existe plusieurs techniques. Tout dabord, réaliser un témoin négatif pour limmunofluorescence indirecte, c'est-à-dire mettre que les anticorps secondaires (marqués) en contact avec léchantillon à analyser. Après une étape de lavage, si le témoin négatif est bon, il ne doit pas avoir de fluorescence émise, car les anticorps secondaires nont pas pu se fixer, et ils sont donc partis après létape de lavage. Ensuite, lutilisation de caméra haute résolution et haute sensibilité atténue le photoblanchiment et permet une étude quantitative de l'acquisition.

Domaines d'utilisation[4]

On peut distinguer deux domaines:

Le diagnostic

  • En bactériologie, on utilise limmunofluorescence pour une détection directe de bactéries dans les liquides biologiques. Mais aussi pour la recherche danticorps anti-microorganisme, par immunofluorescence indirecte.
  • En virologie, limmunofluorescence directe est utilisée pour réaliser des cinétiques dapparition dantigène cellulaire ou viral. Et limmunofluorescence indirecte est employée pour une recherche dun virus dinfection.
  • En anatomie pathologique (réalisation dune biopsie), limmunofluorescence directe sert à déceler les dépôts dimmunoglobulines ou des protéines du complément dans les tissus. Ensuite en cancérologie, on peut quantifier lexpression doncogènes par cytofluorimétrie. Enfin, limmunofluorescence peut servir à déterminer la qualité du sperme, afin de diagnostiquer une stérilité.

la recherche fondamentale

  • Observation de la division cellulaire
  • Analyse du cycle cellulaire, dont l'apoptose
  • Activation cellulaire
  • Hybridation moléculaire
  • Localisation intracellulaire, on peut utiliser la vidéo microscopie, mais aussi les protéines recombinantes.

Innovations

  • Il existe des programmes de quantification et de reconstruction 3D, couplé à un microscope confocal ou à épifluorescence. Avec aussi, un programme de déconvolution, qui améliore la netteté de limage ou de la vidéo.
  • Phénotypage cellulaire en haut-débit, en plaque quatre-vingt seize puits par exemple.


L'immunofluorescence est utilisée sur les cellules en culture (on parlera alors d'immunocytochimie) ou sur des coupes de tissus (immunohistochimie).

Sources

  1. [1]
  2. Immunologie, 4° Edition, EM inter
  3. Immunologie générale connaissance et pratique, 8° édition revue et complétée ,MASSON
  4. [2]

Wikimedia Foundation. 2010.

Contenu soumis à la licence CC-BY-SA. Source : Article Immunofluorescence de Wikipédia en français (auteurs)

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