- Denaturation de l'ADN
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Dénaturation de l'ADN
La dénaturation de l'ADN, ou fonte de l'ADN, est un processus qui conduit à transformer un double brin d'ADN en deux simples brins, en rompant les liaisons hydrogène entre les bases azotées des deux chaînes complémentaires de l'ADN.
Cette dénaturation peut être réalisée in vitro en soumettant l'ADN à tout agent chimique ou physique capable de déstabiliser les liaisons hydrogène, comme le pH, la température, certains solvants, des concentrations ioniques élevées, des agents alcalins,...
Contrairement à la dénaturation des protéines, celle de l'ADN est parfaitement réversible, lors d'un retour suffisamment lent aux conditions initiales : les bases se réapparient naturellement. C'est la renaturation, ré-association des deux brins de l'ADN qui se recombinent en une seule molécule bicaténaire.
La dénaturation peut être facilement suivie par spectroscopie à 260 nm de par l'existence d'un effet hyperchrome. La coefficient d'absorption ε de la molécule est augmenté d'un facteur environ 1,4 au cours de la transition double brin → simple brin.
Paramètres influant la dénaturation
La stabilité du duplexe formé par deux chaînes d'ADN associées en double hélice est due la somme de trois forces :
- La force de répulsion électrostatique directement liée à la présence de charges négatives tout le long de chaque molécule (phosphate), qui est déstabilisante pour la double hélice d'ADN ;
- la force d'interaction dipôle-dipôle appelée liaison hydrogène qui stabilise l'ADN natif ;
- la force hydrophobe de résonance entre les électrons pi des bases empilées (la plus faible).
Le pH, la force ionique (contribution des ions), l'activité de l'eau (Aw) peuvent moduler la force de répulsion. Le coefficient de Chargaff (%GC), la longueur de la molécule, la présence d'agents dénaturants tels que l'urée, le formamide, influe sur la force de stabilisation des liaisons hydrogènes.
Dénaturation par hausse de la température
La température à laquelle la moitié des molécules d'ADN est dénaturée est appelée température de fusion moléculaire. On peut suivre ce processus de dénaturation de manière spectroscopique et mesurer la température de fusion, grâce à l'effet hyperchrome. Celui-ci correspond à une augmentation de l'absorption dans l'UV lors du passage duplex → simple brin.
Lorsque la température retombe, les chaînes complémentaires se réassocient deux par deux avec réapparition des liaisons H. La composition nucléotidique de la chaine a un effet sur la température de fusion : des chaînes contenant beaucoup de bases C et G (impliquant 3 liaisons H entre les nucléotides en vis-à-vis sur les deux brins) seront plus difficiles à dénaturer que des chaines contenant plus de bases A et T (2 liaisons).
La dénaturation de l'ADN peut se faire avec un thermocycleur.
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