Chromatographie sur couche mince

La chromatographie sur couche mince ou chromatographie planaire (CCM, en anglais TLC pour Thin layer chromatography) est une technique de chromatographie couramment utilisée pour séparer des composants dans un but d'analyse (CCM analytique) ou de purification (CCM préparative).

Elle comprend :

• une phase stationnaire : une couche mince de matériel absorbant (usuellement du gel de silice, de l'oxyde d'aluminium ou de la cellulose)
• une phase liquide, dite phase mobile ou éluant : un solvant ou un mélange de solvants qui va entraîner les composés à séparer le long de la phase stationnaire.

Le phénomène d’adsorption est prépondérant (mais il y a également partage si le solvant est un mélange).

Constitution d'une plaque de CCM

Une plaque de CCM est un support en verre, en aluminium ou en plastique sur lequel a été étalé une phase stationnaire en couche uniforme. L'épaisseur de cette couche est de l'ordre de 0,2 mm (200 μm) pour une plaque analytique et 1-3 mm pour une plaque préparative. Avant étalement, la phase stationnaire est une poudre fine et elle doit donc être mélangée à un liant qui assure la bonne cohésion de la couche et une bonne adhérence au support. On utilise le plus fréquemment un liant inorganique comme du gypse, du plâtre, du sulfate de calcium hémihydraté, ou un liant organique (par exemple l'alcool polyvinylique) notamment lorsque la phase stationnaire est hydrophobe.

On ajoute souvent un pigment fluorescent pour permettre une détection des produits à la lumière ultraviolette à 254 nm ou 366 nm ; à cette longueur d'onde, le pigment de la phase stationnaire émet une lumière, verte en général, sauf aux endroits où un produit absorbe le rayonnement UV ce qui provoque l'apparition de taches sombres.

Mode opératoire

L'exemple ci-dessous montre les différentes étapes de la procédure pour la préparation, l'élution et la révélation de plaques de CCM pendant le suivi de l'avancement d'une réaction chimique. On considère que la phase stationnaire est un gel de silice standard comportant un indicateur fluorescent.

Chaque trait est à écrire au crayon à papier, car les encres des plumes ou des stylos sont solubles dans la plupart des éluants, donc fausseraient la chromatographie.

• On trace un trait horizontal (la ligne de base) à environ 1 cm du bas de la plaque de CCM. Les marques D, B et M représentent respectivement le produit de Départ, le Brut réactionnel et le point Mixte (un mélange de D et B). Le point mixte permet de mieux visualiser les taches lorsqu'elles sont très proches ou lorsque l'étape d'élution est imparfaite.
• On dépose, à l'aide d'un capillaire ou d'une microseringue, une petite quantité d'une solution du produit de départ sur les marques D et M et une petite quantité du brut réactionnel sur les marques B et M. Dans cet exemple, le produit de départ est incolore (cercle en pointillé) alors que le brut réactionnel est légèrement coloré.
• On prépare à côté, un éluant qui recouvrira le fond de la cuve sur environ 5mm de hauteur, et on laisse saturer la cuve. (C'est-à-dire : laisser la cuve fermée et laisser les vapeurs de l'éluant 'remplir' le volume de la cuve, environ 5-10 min).
• On place la plaque de CCM dans la cuve contenant l'éluant. Le solvant monte le long de la plaque par capillarité. Lorsqu'il arrive presque en haut de la plaque, on sort celle-ci de la cuve, on marque la ligne de front (là où l'éluant s'est arrêté de migrer) et on laisse l'éluant s'évaporer. Ici, on ne voit que les taches 3 et 5 puisque les autres sont incolores. On observe que la tache 5 n'a que très légèrement migré au-dessus de la ligne de base.
• Pour visualiser les différentes taches, on commence par placer la plaque sous une lampe UV à 254 nm. La plaque apparaît en vert fluorescent et les produits qui absorbent les UV apparaissent sous forme de taches sombres. On utilise cette méthode de détection en priorité car elle n'endommage pas la plaque. Dans cet exemple, on voit que le brut réactionnel contient encore du produit de départ (tache 4) mais la taille de la tache indique qu'il y en a moins qu'en début de réaction. On observe la formation d'au moins trois nouveaux produits (1, 2 et 5) : 1 et 2 sont moins polaires que le produit de départ, et 5 est plus polaire. Il semble que le produit 5 est majoritaire dans le brut réactionnel (le produit 2 est beaucoup moins visible) mais tous les produits ne révèlent pas avec la même intensité aux UV.
• On plonge la plaque dans une solution acide de vanilline (il existe de nombreux autres révélateurs) et l'on chauffe la plaque jusqu'à ce que des taches colorées apparaissent. Ici on observe un autre produit (3) qui n'était pas visible aux UV. La tache 1 est à peine visible ; elle l'était beaucoup plus sous lampe UV. La surprise vient de la tache 2 : elle n'était que faiblement visible en UV mais elle révèle très intensément avec la vanilline. Il est fort possible que ce soit le produit majoritaire de la réaction et non le produit 5 comme le laissait supposer la détection UV.

Conclusion : il se produit bien quelque chose lors de cette réaction chimique. Plusieurs produits sont formés mais l'un (n°2) semble nettement majoritaire. Il faudra refaire une CCM un peu plus tard pour suivre la disparition de la tache 4 (produit de départ) dans la colonne B (brut réactionnel) ce qui signifiera que la réaction est terminée. Ensuite, une chromatographie sur colonne permettra d'isoler les différents produits et d'effectuer des analyses plus poussées pour s'assurer que le produit 2 est bien le produit attendu.

Migration des espèces chimiques

La distance de migration des produits dépend de leur affinité avec la phase stationnaire et la phase mobile. Dans l'exemple d'une phase stationnaire polaire (ex : le gel de silice) et une phase mobile apolaire (ex : hexane), les produits polaires auront tendance à peu migrer, voire pas du tout alors que les produits apolaires migreront davantage car entrainés par l'éluant. Les analytes passent régulièrement d'une phase à l'autre durant l'élution. L'affinité joue sur le temps de séjour des analytes dans chaque phase, plus ils ont d'affinité avec la phase stationnaire, plus ils vont y passer du temps, leur temps de rétention total va donc être rallongé.

L'éluant peut être parfois un mélange d'un produit polaire et d'un produit apolaire (par exemple : dichlorométhane/hexane), ce qui permet de faire légèrement migrer même les espèces qui ont une affinité avec la phase stationnaire. Ceci a pour utilité d'éviter que plusieurs produits soient confondus sur la ligne de base.

La migration dépend aussi de l'affinité du solvant (polaire, apolaire) avec la phase stationnaire et la phase mobile.

Elle dépend également de la concentration de l'espèce.

Les sels ou autres édifices ioniques ne migrent en général pas du tout et restent sur la ligne de base.

Rapport frontal

C'est le rapport de la distance de vitesse du soluté sur la masse de migration de l'éluant. Il caractérise une seul espèce chimique.

Révélateurs

lien vers le site du Club de Chromatographie sur Couche Mince : http://www.clubdeccm.com/PDF/Dyeing_Reagents_TLC.pdf ce document PDF très complet donne une description exhaustive (appuyée de références bibliographiques) de 335 révélateurs.

Révélation au permanganate de potassium

• 10 g de K₂CO₃
• 1,5 g de Permanganate de potassium (KMnO₄)
• 150 ml d'eau distillée
• 1,25 ml d'Hydroxyde de sodium (NaOH) en solution à 10 %

On l'utilise sprayé ou par trempage et cela donne une coloration jaune/marron des produits sur un fond violet/rose. Il est utilisable sur les plaques Alumine et Silice. L'avantage par rapport à d'autre produits de révélation est qu'il n'est pas nécessaire de chauffer (on peut donc révéler les plaques sur plastique).

Astuces

Eviter la marque au front de migration

Bien souvent, les plaques commerciales sont recouvertes d'un produit (pour l'instant non déterminé), qui vient perturber la révélation. En effet, on se retrouve bien souvent avec une ligne au niveau de ce front. Elle est souvent considérée (à tort) comme la marque des solvants utilisés. Mais une méthode simple pour eviter ce phénomène est de faire migrer intégralement la plaque dans le système de solvant que l'on va utiliser par la suite et de la laisser bien sécher avant utilisation. L'avantage principal de cette technique est de permettre de voir plus clairement si des produits ont migré sans être retenus par la phase solide.

Affiner les dépôts

Un dépôt idéal est une ligne fine faite en une seule fois. Cependant, en fonction de l'origine du produit déposé, cela n'est pas forcément facile. On peut utiliser un solvant fort (acétone/méthanol 90:10 sur de la silice par exemple) que l'on va utiliser pour faire migrer l'intégralité la fraction déposée et ce seulement sur quelques millimètres. Ainsi on se retrouve bien souvent avec une ligne bien nette ce qui permet de discriminer plus facilement des produits ayant des comportements relativement proches sur la plaque. Il faut par contre s'assurer séchage complet de la plaque avant de poursuivre avec le développement.

Découpage d'une plaque souple

Les plaques sur support souple sont faites pour être découpées. Cependant, la phase solide se détache facilement de ce support, et au moment de la découpe s'émiette provoquant ainsi divers artefacts lors du développement de la plaque (effets de bord dans lesquels un côté de la plaque va migrer plus vite que l'autre). Pour éviter cela, lors de la découpe, on peut pencher les ciseaux à 45° dans le sens des aiguilles d'une montre (pour des ciseaux droitiers, l'inverse pour des gauchers) dans l'axe de la découpe.

Exemples

• 

  CCM d'une encre noire (une encre noire est un mélange d'encres de plusieurs couleurs)

• 

  CCM de 10 huiles essentielles (révélation à la vanilline)

Voir aussi

• Far-eastern blot (également appelé Thin Layer Chromatography Blot), une technique d'analyse des lipides.

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