Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Introduction

Dans les années 1960, le Dr Shimomura mit en évidence un phénomène de bioluminescence existant chez un organisme marin, la méduse Aequorea victoria. Quelques années plus tard lextraction et la purification dune protéine bioluminescente, appelée aequorine, permit de démontrer son rôle dans la luminescence naturelle de cet organisme. Laequorine sest révélée être par la suite un complexe moléculaire formé dune protéine de 21 kDa ou apo-aequorine possédant trois sites de haute affinité pour le calcium, doxygène moléculaire et dun chromophore, la coelenterazine. Lorsque trois ions calcium se lient à lapo-aequorine, il se produit un changement conformationnel permettant loxydation de la coelenterazine en coelenteramide qui se trouve alors dans un état excité. Le complexe ainsi formé est aussi appelé : blue fluorescent protein. En effet, in vitro, la réaction se termine par la libération dune molécule de CO2 et lémission dune lumière bleue avec un pic à 469 nm (nm = nanomètre) [1]. Cependant, in vivo, la bioluminescence de certaines cellules de la méduse nest pas de couleur bleue mais verte. En 1974 fut établie lexistence dun transfert dénergie de laequorine vers une protéine isolée à partir du même organisme, la GFP (Green Fluorescent Protein). Lexcitation de la GFP par laequorine au cours du transfert dénergie est responsable dune émission dans le vert avec un pic à 510 nm[2] (Figure 1).

Figure 1. La bioluminescence naturelle dAequoria Victoria. Mécanisme de production de lumière par le système Aequorine - GFP.

Par la suite dautres organismes présentant des mécanismes de bioluminescence semblables ont été identifiés. Parmi ces organismes, Renilla reniformis (pensée de mer) possède une enzyme de 36 kDa, la Renilla luciférase, qui catalyse l'oxydation de la coelenterazine (luciférine) en présence doxygène mais sans nécessité dun cofacteur (calcium). In vitro, cette réaction catalytique produit une lumière bleue avec un pic d'émission à 480 nm[3]. Comme pour laequorine, la présence dune GFP chez Renilla Reniformis permet un transfert dénergie qui se traduit par une émission dans le vert à 510 nm.

Utilisation du BRET en biologie

Figure 2. La technologie BRET. A. En fonction du type de substrat dégradé, la Rluc (Renilla Luciférase) émet dans le bleu à 480 nm (Coelenterazine H, BRET1) ou à 395 nm (DeepBlueC, BRET2). La YFP (BRET1) est excitée à 480 nm et émet à 530 nm alors que la GFP2 (BRET2) absorbe à 395 nm et émet à 510 nm. B. Spectres démission du donneur et de laccepteur en BRET1 et en BRET2.

Lidentification puis le clonage des protéines impliquées dans un processus naturel de BRET (cf. ci-dessus) ont permis dadapter ce système à létude des protéines en cellules vivantes. La particularité du BRET vient de la nature du donneur. En effet, il sagit dune molécule luminescente, la coelenterazine, dont lexcitation est déclenchée par une enzyme, la Renilla Luciferase (Rluc). Comme pour le FRET, laccepteur du BRET peut être une protéine fluorescente comme la GFP ou la YFP. Pour linstant, le BRET est limité à des applications au format fluorimètre. En effet, lanalyse microscopique du signal de BRET est rendue difficile par la faible intensité démission de la Rluc.

Le BRET est un processus qui dépend entre autres, de la distance séparant le donneur de laccepteur. Ainsi, lorsque la Rluc et la YFP se trouvent à proximité (d < 10 nm), un transfert dénergie peut avoir lieu entre les deux molécules avec lémission dune fluorescence caractéristique à 530 nm (Figure 2). Lexcellente compatibilité de ces deux molécules en fait un couple très utilisé pour létude des interactions protéiques. Pour cela, les protéines dintérêt sont fusionnées à la Rluc ou la YFP avant dêtre exprimées dans la cellule. En absence de toute interaction, lajout de coelenterazine sur des cellules co-exprimant les deux protéines recombinantes se traduit par un spectre démission avec un pic centré à 480 nm. Toutefois, si les deux protéines sont en interaction un deuxième pic caractéristique du BRET apparaît aux environs de 530 nm. Ce pic correspond à lémission de la YFP excitée par le transfert dénergie provenant de la réaction enzymatique.

Expérimentalement, le BRET est déterminé ratiométriquement en divisant lémission de laccepteur à 530 nm par lémission du donneur à 480 nm. Ce mode ratiométrique permet déliminer les variations de signal dues à des fluctuations de la lumière émise (interférences optiques des milieux, variations du nombre de cellules, volume de lessai…). De plus, lutilisation dune enzyme pour exciter le donneur luminescent (coelenterazine) permet de saffranchir dune source excitatrice extérieure évitant ainsi les problèmes de photoblanchiment des GFP, deffet de filtre des milieux à la longueur donde dexcitation du donneur ou encore de lexcitation croisée de laccepteur. Enfin, les taux dexpression relatifs des molécules peuvent être quantifiés séparément en mesurant la luminescence du donneur à 480 nm et la fluorescence de laccepteur à 530 nm.

Cependant, comme pour le FRET, le signal sur bruit dun essai en BRET est significativement affecté par le recouvrement des spectres démission du substrat de la Rluc et de la YFP. Pour cette raison, une version améliorée du BRET, nommée BRET2 a été développée[4]. Dans cette version, un analogue de la coelenterazine, le DeepBlueC, est utilisé comme substrat de la Rluc (Figure 2). Ce substrat se caractérise par une émission de fluorescence significativement décalée de 480 à 400 nm. Un accepteur nommé GFP2 a été spécialement développé afin de présenter un pic dexcitation à 400 nm et un pic démission à 510 nm. Ainsi, la résolution spectrale du BRET2 est significativement améliorée par rapport au BRET classique avec une séparation presque complète des spectres démission (déplacement de Stokes de 115 nm en BRET2 et de 50 nm en BRET standard). Le rapport déterminé dans le BRET2 (510 nm / 400 nm) présente par conséquent un bruit de fond négligeable. Néanmoins, lutilisation du DeepBlueC comme substrat de la Rluc donne un rendement quantique (rapport du nombre de photons émis sur le nombre de photons absorbés par une molécule) beaucoup plus faible que celui de la coelenterazine. La nécessité davoir un lecteur sensible pour le BRET2 est une limite à lutilisation de cette technologie.

Lapproche BRET a été particulièrement utilisée pour analyser loligomérisation (association de protéines) et lactivation des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Plus sensible que le FRET CFP/YFP et adaptable au format microplaque, le BRET est un outil de choix pour létude des protéines en cellules vivantes. Toutefois, comme pour le FRET, cette technologie ne permet pas de discriminer aisément le signal de BRET provenant des interactions entre les protéines de surface du signal provenant des protéines retenues dans les compartiments intracellulaires.

Notes et références

  1. Shimomura and Johnson, 1969
  2. Morise et al., 1974
  3. Matthews et al., 1977; Wampler et al., 1971
  4. Bertrand et al., 2002; Jensen et al., 2002; Vrecl et al., 2004



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Contenu soumis à la licence CC-BY-SA. Source : Article Bioluminescence Resonance Energy Transfer de Wikipédia en français (auteurs)

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