Southern Blot

Southern Blot

Southern blot

Un transfert d'ADN[1] est une méthode de biologie moléculaire permettant l'analyse de l'ADN.

Sommaire

Principe

Nous partons des fragments d'ADN obtenus par les enzymes de restriction. On va appliquer la technique du transfert de Southern pour fixer les sondes aux fragments leur correspondant; une sonde étant un fragment d'ADN auquel on a marqué une base grâce à des composés radioactifs, fluorescents ou un anticorps qui sert à localiser une séquence de l'ADN qui nous intéresse. Le transfert de Southern sert donc à repérer des fragments d'ADN. D'une façon plus générale, ces fragments obtenus vont présenter des polymorphismes de restriction. Un polymorphisme de restriction est une variation individuelle de la séquence des bases du génome des eucaryotes modifiant un ou plusieurs sites de restriction. Donc, ces polymorphismes de restriction (mutations) vont, dans les faits, être intéressants pour déterminer des variations géniques, des tests de paternité par exemple.

Méthode

  1. L'ADN est digéré par les enzymes de restriction
  2. L'ADN digéré est fractionné en gel d'agarose puis coloré au Bromure d'Ethidium (BET)
  3. Séparation des fragments digérés par électrophorèse, elle se fait en conditions non dénaturantes car l'ADN est double brin. Les gels utilisés pour la séparation des fragments d'ADN génomiques sont faiblement concentré en agarose (0,6 à 0,8%)
  4. Le gel d'électrophorèse est trempé dans une solution alcaline (contenant habituellement de l'hydroxyde de sodium) afin de permettre la dénaturation de l'ADN bicaténaire (séparation de l'ADN double-brin en simple-brin).
  5. Une feuille de membrane en nitrocellulose (ou encore en nylon) est placée sur le gel. Une pression est appliquée au gel en plaçant une pile de serviettes de papier et par un poids sur la membrane et le gel, par exemple. Ceci va permettre le déplacement de l'ADN contenu dans le gel sur la membrane par capillarité grâce à une solution saline. L'ADN va se fixer sur la membrane.
  6. La membrane est alors chauffée, dans le cas de nitrocellulose, ou exposée au rayonnement ultraviolet si c'est du nylon, et ce, afin de fixer de manière permanente l'ADN sur la membrane.
  7. La membrane est ensuite mise en contact avec une sonde spécifique de la séquence d'ADN recherchée. La sonde est marquée de sorte qu'elle puisse être détectée, par incorporation de radioisotopes ou par "étiquetage" de la molécule avec un fluorophore ou un antigène tel que la digoxygénine. Dans certains cas, la sonde peut être faite à partir d'ARN, plutôt que d'ADN.
  8. Après hybridation, la sonde en excès est éliminée de la membrane par différents lavages, et l'hybridation est visualisée sur un film autoradiographique, dans le cas d'une sonde radioactive ou fluorescente.

Résultat

La sonde va révéler la position sur la membrane des fragments d'ADN recherchés. Plusieurs situations peuvent se présenter :

  • Les fragments d'ADN sont semblables au lieu d'hybridation de la sonde et à proximité de celui-ci et les fragments sont de même taille : il n'y a pas de polymorphisme.
  • Un site de restriction au voisinage de la sonde n'est présent que chez l'un des deux individus; les fragments n'ont pas la même taille et ne sont donc pas à la même hauteur sur le gel: il y a polymorphisme de sites de restriction.
  • Les sites de restriction sont identiques, mais une séquence supplémentaire est présente chez l'un des deux fragments. Les vitesses de migration des fragments et donc leur position sur le gel sont donc, ici aussi, différentes : il y a polymorphisme d'insertion/délétion.

Notes

  1. Voir l'article Transfert (biologie moléculaire) pour un complément sur la terminologie francophone à utiliser. Cette technique est également appelée Southern blot(en), en l'honneur de son inventeur Edwin Southern, ou buvardage de Southern.

Lien externe

  • Portail de la biochimie Portail de la biochimie
  • Portail de la biologie cellulaire et moléculaire Portail de la biologie cellulaire et moléculaire
Ce document provient de « Southern blot ».

Wikimedia Foundation. 2010.

Contenu soumis à la licence CC-BY-SA. Source : Article Southern Blot de Wikipédia en français (auteurs)

Игры ⚽ Нужно сделать НИР?

Regardez d'autres dictionnaires:

  • Southern blot — Southern blot, hibridación Southern o, simplemente, Southern es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla compleja de este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de… …   Wikipedia Español

  • Southern-Blot — Autoradiogramm eines Southern Blots Beim Southern Blot handelt es sich um eine 1975 von Edwin Southern entwickelte molekularbiologische Untersuchungsmethode für DNA.[1] Sie ermöglicht den Nachweis einer Gensequenz in einem komplexen DNA–Gemisch… …   Deutsch Wikipedia

  • Southern Blot — Autoradiogramm eines Southern Blots Beim Southern Blot handelt es sich um eine 1975 von Edwin Southern entwickelte molekularbiologische Untersuchungsmethode für die DNA.[1] Sie ermöglicht den Nachweis einer Gensequenz in einem komplexen DNA… …   Deutsch Wikipedia

  • Southern blot — A test commonly used in molecular biology and genetics, the purpose of the test being to check for a match between DNA molecules. In the Southern blot technique, DNA fragments are separated by a method called agarose gel electrophoresis,… …   Medical dictionary

  • Southern blot — A Southern blot is a method routinely used in molecular biology to check for the presence of a DNA sequence in a DNA sample. Southern blotting combines agarose gel electrophoresis for size separation of DNA with methods to transfer the size… …   Wikipedia

  • Southern blot — Un transfert d ADN[1] est une méthode de biologie moléculaire permettant l analyse de l ADN. Elle a été inventée par Edwin Southern, un professeur britannique de biologie moléculaire. C est ce nom qui a, par jeu de mot, inspiré l appellation de… …   Wikipédia en Français

  • Southern blot — 1. noun A sheet to which DNA has been transfered from electrophoresis gel. 2. verb To use a Southern blot on (some DNA) …   Wiktionary

  • Southern blot analysis — see Southern blot, under blot …   Medical dictionary

  • Southern blot hybridization — see Southern blot, under blot …   Medical dictionary

  • southern blot — noun Usage: usually capitalized S Etymology: after Edwin M. Southern b1938 British biologist : a blot consisting of a sheet of cellulose nitrate or nylon that contains spots of DNA for identification by a suitable molecular probe compare northern …   Useful english dictionary

Share the article and excerpts

Direct link
Do a right-click on the link above
and select “Copy Link”