- Phytochélatine
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Structure générale d'une phytochélatine.
Les phytochélatines (PCs) sont des polypeptides de poids moléculaire compris entre 1,5 et 4 kDa dont leur chaîne principale possède une répétition du dipeptide γ-Glu-Cys suivi par le terminal Gly donc, la structure de base des phytochélatines est (γ-Glu-Cys)n-Gly où n varie entre deux et onze. Elle se classe, avec la métallothionéine (MT) et certains acides organiques, parmi les agents de chélation naturels. Les phytochélatines sont responsables de la tolérance des plantes aux ions métalliques notamment au cadmium (Cd2+). Les phytochélatines ont été isolés pour la première fois en 1985 à partir de cellules des cultures en suspension.
Sommaire
Synthèse des phytochélatines
La synthèse des phytochélatines est réalisée à partir d’une enzyme, la gamma-glutamylcystéine dipeptidyl transpeptidase, communément appelée la phytochélatine synthase (PCS). Cette enzyme utilise le glutathion (GSH), qui fournit des groupements γ-Glu-Cys-Gly, afin de synthétiser la phytochélatine. Ci-joint, un résumé de cette synthèse :
PCS γ-Glu-Cys-Gly + (γ-Glu-Cys)n-Gly ─────▷ (γ-Glu-Cys)n+1-Gly + Gly (GSH) (phytochélatine)Une quantité importante d’ions métalliques changent la conformation de la PCS en une conformation la rendant active. L’expression de cette enzyme est régulée selon la toxicité métallique du milieu auquel l’organisme est exposé. Les métaux qui induisent la synthèse de phytochélatines sont des métaux lourds tels que Cd, Ag, Pb, As, Cu.
La PCS a été identifiée et caractérisée pour la première fois en 1999. La reconnaissance d’ions métalliques se fait dans la partie C-terminale des phytochélatines alors que la partie N-terminal agit comme un domaine catalytique. La chélation se fait à partir de liaisons formées entre les unités sulfures de la cystéine et l’ion métallique comme nous indique la figure suivante :
Chélation du cadmium par les unités cystéines d'une phytochélatine.La phytochélatine (PC) possède des domaines de reconnaissances qui sont reconnus par les vacuoles d’une cellule. Ainsi, le complexe PC-Ion métallique est capté et transporté dans la vacuole par le biais d’un transport actif utilisant un transporteur spécifique aux phytochélatines et l’ATP. Dans la vacuole, les phytochélatines sont dégradés en acides aminés et les ions métalliques sont liés à des acides organiques. Ainsi, en empêchant l’excès d’ions métalliques à circuler librement dans le cytoplasme par formation de complexes avec ces derniers et en s’engageant à leur séquestration vacuolaire, les phytochélatines forment un atout indispensable quant à la tolérance aux ions métalliques.
Processus de synthèse d'une phytochélatine et de la séquestration vacuolaire du cadmium par le biais d'une phytochélatine.Techniques analytiques
Plusieurs techniques analytiques sont impliquées pour la détermination des phytochélatines comme le montre le tableau ci-dessous mais le choix de la méthode varie selon la matrice.
Différentes techniques analytiques utilisées dans le dosage des phytochélatines.La technique analytique la plus sensible pour détecter les phytochélatines dans les phytoplanctons des eaux naturelles est celle de HPLC couplée d´un détecteur de fluorescence dont sa limite de détection est de l’ordre de pM.
Détection des phytochélatines dans les phytoplanctons des eaux naturelles
Pour faire l´analyse des phytochélatines, on doit passer par les étapes suivantes : Échantillonnage, filtration de l´échantillon, extraction des thiols, réduction des groupements thiols, dérivatization des thiols, analyse des dérivées thiols par HPLC.
- Échantillonnage
Doit se faire dans avec des bouteilles (2 - 4L) en polycarbonate, lavées à l´acide (1 M HCl) puis rincées au minimum trois fois par l´eau Milli-Q. le prélèvement de l’échantillon se fait à 0.3 m de profondeur d’une eau naturelle.
- Filtration de l´échantillon
Une filtration sous vide doit être nécessaire avec une pression (<5psi) et cela en utilisant des filtres en nitrocellulose 47mm de diamètre dont la taille des pores est de 0.8µM. ensuite ces filtres (contenant les phytoplanctons) seront placés dans des microtubes.
- Extraction des thiols
L’extraction se fait par un ajout (aux microtubes) de 1.2 mL HCl 0.1M (dénature les enzymes capables de dégrader les groupements thiols des peptides) contenant 5mM DTPA (diminue l´oxydation des groupements thiols par le métal), ensuite placé dans un ultrasonicateur (0 °C ; 5 minutes), puis les cellules extraites seront centrifugées (20min; 13000g; 4 °C).
- Réduction des groupements thiols
Le TCEP est le réactif réducteur utilisé, une addition au surnageant (250µL) un volume de 25µL de TCEP 20mM (préparé dans 200mM HEPES/ 5mM DTPA (pH=8.2)) peut réduire les thiols oxydés selon la réaction suivante :
Réduction des thiols par le TCEP.- Dérivatisation des thiols
Plusieurs réactifs peuvent être utilisés pour la dérivatisation des thiols tel que le DTNP (n’est pas sensible pour la détection des PCs dans les phytoplanctons), OPA (stable pour une courte durée), NPM (formation des diastérioisomères), SBD-F et MBrB.
Divers agents de dérivation chimique sont possibles pour la dérivatisation des thiols.Seuls les SBD-F et MBrB sont utilisés pour la dérivatisation des thiols des phytoplanctons. Dans cette expérience ils ont choisi le MBrB (1 mM dans l’acétonitrile), après 15 minutes on arrête la réaction en ajoutant MSA (0.1M) et l’échantillon sera mis dans le froid (4 °C) et à l’abri de la lumière.
Analyse des thiols par HPLC
Diagramme d'un système HPLC (High Performance Liquid Chromatography) un système de chromatographie liquide à haute performance.La HPLC en phase inversée (colonne C-18) est la meilleure technique pour la séparation des PCs dont les deux pompes (Merck-Hitachi Models L-6200 et L-6000), la valve d’injection(100-µL), le détecteur à fluorescence (FD-300, Dionex), la longueur d’onde d’excitation est 380nm et celle d’émission 470nm, la phase mobile est formée par un gradient de concentration (solvant A est l’eau, solvant B est l’acetonitrile): 0–13 min, 10–21% B; 13–33 min, 21–35% B;33–40 min, 35–100% B; 40–50 min, isocratique 100% B;50–65 min, 100–10% B. finalement le débit est de 1.0 mL/min. toutes ces conditions chromatographiques sont produites par un « single run » dont le chromatogramme obtenu est le suivant :
Chromatogramme d’un extrait de Phaeodactylum tricornutum (exposé à 1.4 l M Cu).La limite de détection pour le GSH et le PC2 sont respectivement 1.0 et 0.9 pM pour un volume d’injection de 100µL.
Notes et références
• [1] Silvia K. Kawakami, Martha Gledhill, Eric P. Achterberg, Trends Anal. Chem. vol 25,No 2,2006.
• [2] J.M. Rosenfeld, Trends Anal. Chem. 22 (2003) 785.
• [3] S. Nyberg, L.Z. Zhou, Ecotoxicol. Environ. Safety 32 (1995) 147.
• [4] V. Vacchina, K. Polec, J. Szpunar, J. Anal. Atom. Spectrom. 14 (1999) 1557.
• [5] V. Vacchina, R. Lobinski, M. Oven, M.H. Zenk, J. Anal. Atom.Spectrom. 15 (2000) 529.
• [6] W.A. Kleinman, J.P. Richie, J. Chromatogr., B 672 (1995)73.
• [7] Mun’delanji VESTERGAARD, Sachiko MATSUMOTO, and Masahiro TAKAGI, Chelation of Cadmium Ions by Phytochelatin Synthase: Role of the Cystein-rich C-Terminal, Analytical Science February 2008, VOL. 24 277, The Japan Society for Analytical Chemistry.
• [8] Rakesh Minocha, P. Thangavel, Om Parkash Dhankher, Stephanie Long, Separation and quantification of monothiols and phytochelatins from a wide variety of cell cultures and tissues of trees and other plants using high performance liquid chromatography, Journal of Chromatography A, 1207 (2008), p.72–83
• [9] Yuko OSAKI, Tomoo SHIRABE, Shun TAMURA and Etsuro YOSHIMURA, A Functional putative phytochelatin synthase from the primitive Red Alga, Bioscience Biotechnology Biochemistry, 72 (12), 3306-3309, 2008
• [10] Saul Vasquez, Peter Goldsbrough, Ramon O. Carpena, Comparative Analysis of the contribution of phytochelatins to cadmium and arsenic tolerance in soybean and white lupin, Plant Physiology and Biochemistry 47 (2009), p. 63-67Liens externes
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