- ADN-Bleu de toluidine
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La gélose à ADN au bleu de toluidine est utilisée pour déterminer la présence d'une activité nucléase chez un micro-organisme.
En routine, on l'utilise pour identifier l'expression d'une DNAse thermorésistante (ou thermonucléase) caractéristique de l'espèce Staphylococcus aureus.
Sommaire
Usage
Recherche de la DNAse thermorésistante de Staphylococcus (Microbiologie alimentaire et médicale)
Composition
- ADN …………………………………….. 0,3 g - Solution de Bleu de toluidine (0,1 mol/µL) ….. 3 mL - Tampon TRIS pH 9 (50 mmol/µL) ……………… 1 µL - Solution de chlorure de calcium (10 mmol/µL) … 1 mL - Chlorure de sodium ……………………….. 10 g - Agar-agar………………………………… 10 g
(pH = 9)
Préparation
Milieu prêt à l'emploi. Il est possible de la fabriquer à partir des constituants de base.
Recherche de la DNAse thermostable ou Thermonucléase
La DNAse thermostable est une enzyme qui résiste a la chaleur (100 °C pendant 15 minutes) et qui dégrade l'ADN selon la réaction :
Technique
Ensemencer un bouillon cœur-cervelle pendant 24 heures à 37 °C avec la souche à étudier.
En placer, une partie 15 min au bain-marie (100 °C) et conserver le reste.
Percer la gélose de 3 trous. Inoculer quelques gouttes :
- De bouillon stérile dans le premier puits. (contrôle négatif)
- De bouillon chauffé le second puits.
- De bouillon non chauffé dans le troisième. (facultatif - contrôle positif)
Incuber 4 heures à 37 °C.
Remarques : bien noter le contenu de chaque puits au dos de la boîte de Petri. Limiter à 3 gouttes de bouillon pour ne pas faire déborder les puits. Incuber la gélose sans retourner la boîte !
Lecture
résultats du test avec Staphylococcus aureus possédant une thermonucléase.
L'observation d'un éventuel halo rose signe la présence d'une DNAse autour des trous percés sur le fond bleu de la gélose.
- Puits témoin : contenant du bouillon cœur cervelle stérile
- Puits contenant du milieu cœur cervelle avec la souche a étudier
- Puits contenant du milieu cœur cervelle ensemencé puis chauffé a 100 °C pendant 10 minutes
- Si le puits 1 devient rose, le test est à recommencer.
- Si le puits 2 devient rose et que le puits 3 reste bleu, la souche possède une DNase non thermostable.
- Si les puits 2 et 3 sont roses, la souche possede une DNase thermostable.
Voir aussi
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