QPCR

QPCR

PCR quantitative

La PCR quantitative (synonymes : PCR en temps réel, QPCR) permet de mesurer la quantité initiale d'ADN. En réalité, la PCR quantitative mesure le nombre d'amplicon(portion d'ADN définie par un couple d'amorces).
Il existe diverses techniques permettant de quantifier l'ADN en biologie moléculaire. On peut utiliser la spectromètrie à 260 nm. Une autre technique fiable permettant la quantification de l'expression d'un gène est le Northern blot. Cette technique a été développée historiquement en utilisant l'hyridation de sondes radioactives ou fluorescente sur l'ADN amplifié. Le Northern blot nécessite des sondes radioactives ce qui pose des problèmes au niveau de la sécurité (radioactivité) et du temps d'exposition des films radiographiques (long).


Sommaire

Historique

En PCR en point final

Beaucoup de personnes s'affranchissent de mettre en œuvre les techniques du Northern blot et quantifient à l'aide de la technique de la PCR en point final. Cette quantification est faite selon le postulat que plus il y avait d'ADN au départ, plus il y en a à l'arrivée, à la fin des 40 cycles d'amplification. On quantifie ensuite grossièrement à la lecture des gels d'agarose, grâce à la comparaison des intensités des bandes obtenues avec celles d'un marqueur de poids moléculaire. L'œil humain ne permettant pas de discriminer de façon absolue les différences d'intensité entre les bandes, on peut avoir recours à un logiciel de d'analyse d'images, tel ImageJ. Cependant, la précision gagnée dans la lecture de l'intensité de la bande peut-être compensée par une perte de précision due au côté arbitraire du placement de la ligne de base et à la présence d'un bruit de fond non-homogène sur l'image.

La PCR semi-quantitative

La PCR semi-quantitative est basée sur l'interruption de la PCR en plusieurs cycles qui correspondent à la phase stationnaire (la quantité d'ADN augmente très doucement car il y a peu de d'ADN matrice), la phase exponentielle (croissance rapide) et au plateau (diminution de la quantité de réactifs). Pour un échantillon, il est possible d'estimer la quantité initiale d'ADN si l'on dispose d'un échantillon où la quantité d'ADN est connue (étalon). Leur amplification par PCR, l'arrêt de la réaction entre le 20e et le 30e cycle PCR et la comparaison entre les intensités lumineuses des produits PCR marqués au BET permettent d'estimer la quantité initiale d'ADN. Pour deux échantillons, il est possible de comparer leur quantité d'ADN initiale en arrêtant la PCR avant le plateau de la PCR (<30 cycles).

La PCR compétitive

En PCR en temps réel

Courbe étalon en PCR Quantitative

Le principe de la PCR en temps réel repose sur la possibilité de suivre la quantité d'ADN présente dans la réaction à tout instant et non à la fin de la PCR (PCR point final)ou au cycle n<40 (PCR semi-quantitative). Des sondes fluorescentes se fixent soit sur l'ADN double brin (technologie SYBR) ou sur une séquence d'ADN précise (technologie Taqman et Beacon). Ces sondes ne fluorescent qu'une fois fixées à l'ADN (soit à cause d'un "quencher" soit car la fluorescence nécessite un ADN double brin). Un seuil de fluorescence est établie par le programme de la machine de PCR en temps réel. Une fois que la quantité d'ADN permet aux sondes fluorescentes de dépasser ce seuil alors on obtient un numéro de cycle PCR appelé "Ct"pour "Cycle Threshold" ou cycle seuil. C'est cette valeur qui est à la base des calculs pour quantifier l'ADN de façon absolue ou relative. Il est important de connaître l'efficacité E de la PCR. Pour cela, on effectue une PCR en temps réel sur des échantillons de dilution croissante pour obtenir une courbe étalon correspondant au couple d'amorces utilisé (spécifiques du locus d'intérêt). Par exemple, une série de dilution au 1/2 (D<inf>n+1<inf>=D<inf>n<inf>/2) doit, en théorie, donner des courbes d'amplification décalées d'un cycle PCR à chaque fois. Si tel est le cas, la réaction a alors une efficacité égale à 2 (la quantité d'ADN double à chaque cycle). En pratique, le programme de la machine de PCR en temps réel peut calculer l'efficacité E de la réaction. Plus souvent, une PCR en temps réel sur une série de dilution avec une quantité d'ADN initiale connue permet de calculer l'efficacité de la réaction. Les Ct sont placées sur un graphe en échelle logarithmique et l'équation de la régression linéaire passant par ces points donne l'éfficacité (c'est le coefficient directeur).

Quantification absolue

Durant la partie de la courbe en sigmoïde de l'échantillon, après la ligne de seuil de détection, au moment où l'amplification est exponentielle, on a :


Qn = Qo.En (1)


où :
Q est la quantité d'ADN
n est l'indice du nième cycle
0 est l'indice du cycle de départ
E est l'efficacité de la réaction

donc au cycle de seuil (ct ou threshold cycle), premier cycle au dessus de la ligne de base :

Q_o=\frac{Q_{ct}}{E^{ct}}

Quantification relative

On établit un rapport R entre la quantité d'ADN de départ d'un échantillon et celle d'un témoin, qui n'a pas subi de traitement. Au seuil de détection, on a :

R=\frac{Q_{ct_{ech}}}{Q_{ct_{tem}}}
de (1), on déduit donc :
R=\frac{{E^{ct}_{ech}}} {{E^{ct}_{tem}}}
Soit :
R=E^{({ct}_{ech}-{ct}_{tem})} ou : R = EΔct

Quantification relative corrigée par un gène de référence

Le gène de référence est un gène qui n'est pas induit par le traitement que l'on fait subir pour mesurer la variation du gène cible. Effectuer une correction à partir d'un gène de référence permet d'éliminer les effets de fluctuations.

Bibliographie

Ce document provient de « PCR quantitative ».

Wikimedia Foundation. 2010.

Contenu soumis à la licence CC-BY-SA. Source : Article QPCR de Wikipédia en français (auteurs)

Игры ⚽ Поможем написать реферат

Regardez d'autres dictionnaires:

  • QPCR — Die Real Time quantitative PCR (kurz RTq PCR oder qRT PCR, auch Real Time Detection PCR, kurz RTD PCR) ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase Kettenreaktion (PCR) beruht, und… …   Deutsch Wikipedia

  • QPCR — …   Википедия

  • qPCR — noun A quantitative polymerase chain reaction (PCR) …   Wiktionary

  • QPCR — quantitative polymerase chain reaction …   Medical dictionary

  • QPCR — abbr. Quantitative Polymerase Chain Reaction …   Dictionary of abbreviations

  • QPCR — • quantitative polymerase chain reaction …   Dictionary of medical acronyms & abbreviations

  • Gene expression — For vocabulary, see Glossary of gene expression terms. For a non technical introduction to the topic, see Introduction to genetics. Genes are expressed by being transcribed into RNA, and this transcript may then be translated into protein. Gene… …   Wikipedia

  • Gene expression profiling — Heat maps of gene expression values show how experimental conditions influenced production (expression) of mRNA for a set of genes. Green indicates reduced expression. Cluster analysis has placed a group of down regulated genes in the upper left… …   Wikipedia

  • Genexpressionsanalyse — Heatmaps von Genexpressionsdaten zeigen wie experimentelle Bedingungen die Produktion (Expression) von mRNA für eine Gruppe von Genen beeinflussen. Grün zeigt reduzierte Expression an, während rot für eine verstärkte Expression steht.… …   Deutsch Wikipedia

  • Real-time polymerase chain reaction — In molecular biology, real time polymerase chain reaction, also called quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR) or kinetic polymerase chain reaction, is a laboratory technique based on the polymerase chain reaction, which is used… …   Wikipedia

Share the article and excerpts

Direct link
Do a right-click on the link above
and select “Copy Link”